Laboratoire de biochimie n°9 : « Détermination de l’activité spécifique de la phosphatase et de la dilution appropriée».

Validité de l'Ɛ du pNp du labo fait le 08/04 : Rem.:Nous prenons la valeur théorique d' Ɛ pour nos calculs car notre résultat obtenu pour l'Ɛ expérimental est supérieur à 90% : Ɛ théorique = 18 800 Validité : (valeur exp/valeur th.) x 100 = (45014,57/18800) x 100= 240%

Expliquez les différentes étapes du protocoles (ne pas recopier le protocole); Expliquer les principes théoriques: -Préparation de 2 tubes que l'on nommera «S» et «E» dont: tube S : 800µl de tp EDC pH 4,8 et 800µl de pNpp 2,5mM (substrat) tube E : 400µl de PPase dilué dans du BSA 0,1% (enzyme) On effectuera des dilutions 10x, 25x et 50x de l'enzyme -Mettre les tubes à chauffer au bain-marie à 37° pendant 3min. pour débuter la réaction Enzyme + substrat = Activation du substrat (pNpp devient pNp) : la réaction débute Ajout du substrat activé au NaOH à des temps différents (mettre dans la glace pendant au moins 1min. pour arréter la réaction) et ce pour chaques dilutions. Rem.: Nous observons une coloration jaune apparaitre au fil du temps car le milieu est basique.

Convertissez A405 en µmol de pNp en utilisant Ɛ expérimental si valide,sinon, le détailler en calcul:

Dilution 10x:

Exemple de calcul:

Temps 30 min.: C = 0,703 / 0,0188 = 37,394 µM
Nombre de mol dans 2,4 mL [µM]: 37,394à 1000 mL 0,0897 molß 2,4 mL
Nombre de mol dans 200 µL [µM]: 0,0897 mol
Nombre de mol dans 2mL: 0,0897 mol à 200µl 0,897 mol ß 2000 µL

Dilution 25x:

Dilution 50x:

4) Portez en graphique la quantité de pNp formées dans le milieu réactionnel en fonction du temps de la réaction
Quelle dilution allez-vous utiliser pour la suite?

Quantité de pNp formée dans le milieu réactionnel en fonction du temps de réaction:

Nous allons utiliser la dilution 25x car elle offre une absorbance élevée et car elle est linéaire.