MANUEL QUALITE
12287 mots
50 pages
LES OUTILS DE GENETIQUE MOLECULAIRE4 modules
Module 1 : Les techniques liées aux acides nucléiques
Module 2 : La cartographie
Module 3 : Le séquençage
Module 4 : Les gènes et leur expression
I. LES TECHNIQUES LIEES AUX ACIDES NUCLEIQUES
Sommaire
Préparation des acides nucléiques Extraction/Purification Les enzymes agissant sur les acides nucléiques Dosage et conservation Synthèse in vitro
Séparation des acides nucléiques Electrophorèse Ultracentrifugation
Détection, caractérisation et identification des acides nucléique Marquage et suivi des acides nucléiques Marquage radioactif Marquages froids : colorimétrie, fluorescence ; chimioluminescence ; Hybridation moléculaire Southern Blot Northern Blot Dot Blot Hybridation in situ (HIS)
Amplification et sélection d’acides nucléiques particuliers PCR RT-PCR Clonage Construction de banques Criblage de banques Utilisation des vecteurs recombinés
I.1. Préparation des acides nucléiques
I.1.1. Extraction/Purification
L’ADN (ou l’ARN) doit impérativement être purifié à partir de matériels biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.
Dans la pratique, les acides nucléiques sont souvent extraits du sang total. Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques. Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques. Des traitements par des agents clivant les protéines (protéolyse) peuvent être nécessaires. Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool isopropylique. De nombreux réactifs sont disponibles, prêts à l’emploi, ce qui permet de