Protocole d’extraction d'adn du riz

Pages: 2 (350 mots) Publié le: 11 avril 2012
DNA extraction protocol


• Broyer ~150 mg de feuilles finement ciselées dans 300 µl de tampon d’extraction préchauffé à 74°C à l’aide d’un mortier et pilon
• Lorsque le broyage estcomplet ajouter encore 300 µl de tampon d’extraction et transférer le broyat dans un tube eppendorf de 1.5ml
• Bien mélanger au vortex
• Incuber à 74°C pendant 30 min au bain marie
•Refroidir a température ambiante
• Ajouter 500 µl de chloroforme/isoamylalcool (24:1)
• Mélanger lentement par inversions pendant 3 min
• Centrifuger à vitesse maximale (4000rpm ou12000g) à température ambiante pendant 15 min
• Transférer le surnageant (~420 µl) dans de nouveaux tubes
• Ajouter 270 µl d’isopropanol froid
• Agiter par inversion jusqu’à laformation d’une pelote et mettre à -20°C pendant 15 min
• Centrifuger 15 min à vitesse maximale
• Vider délicatement le surnageant en prenant garde de ne pas faire tomber les culots
•Ajouter 100 µl d’éthanol absolu (90) froid
• Centrifuger 10 min à vitesse maximale
• Jeter le surnageant en prenant garde de ne pas faire tomber les culots
• Sécher sur la paillasse• Ajouter 40 µl de TE 0.1x et laisser suspendre quelques heures à température ambiante, puis mélanger à la pipette. Stocker à -20°C
• Vérifier la concentration (spectrophotomètre, DO260 and280 nm) et la qualité de l’ADN extrait (gel d’agarose 1%).


DNA extraction buffer
Tris 100 mM pH 8
EDTA 20 mM pH 8
NaCl 1.4 mM
MATAB 3%
Bisulfite de sodium 0.5 %
Chauffer à 74°C avant d’ajouter le MATAB et bisulfite de sodium (BS)


PCR reaction mix (25 µl)

dH2O 17.4 µl
10x PCR buffer 2.5 µl
10 mM dNTPs 1 µl
Primer for(10mM) 1 µl
Primer rev (10mM) 1 µl
Taq SBS [5U µl-1] 0.1 µl
DNA template [25 ng µl-1] 2 µl


Digestion mix with Bsp1286I (20 µl)

PCR product 15 µl
10x buffer No4 2 µl
dH2O 2.8 µl...
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