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Purification du lysozyme

2597 mots 11 pages
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PURIFICATION DU LYSOZYME

BUT

Le but de ce travail pratique est de qualifier et de quantifier la protéine majoritaire dans le blanc d'œuf : le lysozyme. Pour cela, il est tout d'abord nécessaire de la purifier à l'aide d'une chromatographie échangeuse d'ions. Ainsi, on pourra mesurer l'activité enzymatique et doser les protéines présentes.

PRINCIPE

Chromatographie échangeuse d'ions

La chromatographie est une méthode d'analyse physico-chimique de séparation. Les constituants d'un mélange se séparent le long d'une phase stationnaire par entraînement d'une phase mobile. Chaque soluté est soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de d'entrainement (due à la phase mobile).

La séparation en chromatographie d'échangeuses d'ions dépend de l'adsorption réversible de molécules chargées sur des groupes échangeurs d'ions immobilisés de charges opposées. Les ions liés par interactions électrostatiques (liaisons ioniques) à un support insoluble et chimiquement inerte, sont remplacés de manière réversible par les ions en solution dans la phase mobile. La phase mobile est un tampon aqueux, la phase stationnaire est une résine sur laquelle sont greffés des groupements chimiques ioniques et accessibles. On peut donc avoir une résine échangeuse d'anions chargée positivement ou une résine échangeuse de cations chargée négativement. ou Remarque : Le choix de la résine échangeuse de cations est explicité dans la partie résultats.

Cette chromatographie se déroule en trois étapes menant à la purification de la molécule d'intérêt : La fixation _ La molécule va se lier spécifiquement aux molécules chargées fixées sur la résine. La purification (ou lavage) _ L'ajout d'un tampon d'équilibration va éliminer les molécules qui n'ont pas d'affinité avec la phase stationnaire, c'est-à-dire les contaminants. L'élution _ L'augmentation du pH va modifier la charge de la molécule qui va alors se détacher du gel et être élué

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