Purification d'un anticorps monoclonal spécifique d'une proteine rho

Pages: 21 (5126 mots) Publié le: 24 février 2011
I. Introduction.

Le laboratoire d’accueil fait partie de l’Inserm plus précisément de l’U563. L’équipe dans laquelle j’ai été accueillie a pour thématique : « Signalisation, GTPases Rho et Cancer ».

L’équipe du Pr Favre de l’unité Inserm U563 s’intéresse à l’implication des petites GTPases, et plus particulièrement des petites GTPases de la sous-famille Rho, dans les processus decancérisation. En effet ces protéines, sont impliquées dans les processus intervenants dans la progression tumorale et la formation des métastases telle que la régulation du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire et les recyclages des récepteurs de facteurs de croissance notamment.

Afin de localiser et de mesurer l’activation des GTPases Rho dans les tissus sains et cancéreux, l’équipetravaille à la mise au point de fragments d’anticorps monoclonaux recombinants, capables de se lier à ces GTPases lorsqu’elles sont dans leur conformation active. C’est dans cette optique que j’ai travaillé sur la validation et la caractérisation des fragments d’anticorps monoclonaux spécifiques de la conformation active des petites Rho GTPases.

II. Généralité sur les proteines Rho et sur les scFv.1. Les petites GTPases Rho

Les petites GTPases Rho sont de petites protéines qui hydrolysent le GTP en GDP passant ainsi d’une forme active (GTP) à une forme inactive (GDP). Ces protéines ont une faible masse moléculaire, entre 20 et 40 KDa, et sont retrouvées dans toutes les cellules eucaryotes.

La famille des protéines Rho comporte environs 20 protéines différentes divisées enquatre groupes parmi lesquels le groupe I qui contient les trois protéines RhoA, RhoB et RhoC qui nous intéressent particulièrement.. La première des trois, Rho A, fut identifiée en 1985. Ce sont des protéines de petite taille (autour de 21 kD) et partagent une homologie de séquence peptidique proche de 85%. Elles sont composées de plusieurs domaines, notamment les domaines appelés Switch I etSwitch II qui déterminent les conformations actives et inactives et une région hypervariable se situant sur l’extrémité C terminale. Les Rho GTPases possèdent également un domaine de liaison au GTP et au GDP.

Les GTPases Rho contrôlent de nombreux processus biologiques, tel que le réarrangement du cytosquelette d’actine, la régulation de la morphologie de la cellule… Elles participent aussi à desfonctions cellulaires comme le contrôle de la prolifération, et l’invasivité des cellules.

2. la localisation des petites GTPases Rho

Pour la plupart, les GTPases Rho sont localisées à la membrane cytoplasmique. Certaines protéines Rho peuvent être localisées à la surface des organites, comme par exemple Rho G qui se localise sur les endosomes et les mitochondries, ou bien Cdc 42 surl’appareil de Golgi. La GTPase Rho A quand à elle, se localise dans les cavéoles de la membrane plasmique lorsqu’elle est activée.

3. Le cycle d’activation

Les proteines Rho alternent entre une forme active (liée au GTP) et une forme inactive (liée au GDP) grâce à deux types de proteines : les GEFs (Guanine Exchange Factors) et les GAPs (GTPases-Activating Proteins). Les proteinesGEFs lorsqu’elles sont activées permettraient de remplacer le GDP lié aux proteines Rho au repos par le GTP, Les proteines GAPs favorisent l’hydrolyse ensuite du GTP en GDP afin que la protéine Rho retrouve un état inactivé.

L’activation des proteines Rho permet leur interaction avec différents effecteurs qui entrainent des signalisations intracellulaires.

Schéma présentant la cyclisation desproteines Rho

4. Les scFv F7 et le D10

Le scFv (single chain variable fragment) est un fragment d’anticorps composé des extrémités variables des chaînes lourdes et légères d’une immunoglobuline reliées par un peptide. Le scFv possède les caractérisques de spécificité et d’affinité de cette immunoglobuline. Le scFv produit par le laboratoire possède une étiquette peptidique 6xHis...
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