Régulation eucaryote (td)
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Exercice 11 Les anticorps de classes IgA et IgM, abondamment présents dans les sécrétions externes des muqueuses intestinales, participent aux défenses immunitaires contre les agents infectieux ingérés. Le gène PIGR joue un rôle essentiel dans ce processus en assurant le transport des Ig au travers de la muqueuse intestinale. Le gène PIGR contient un élément régulateur dénommé motif E, localisé 71 paires de bases en amont du site d’initiation de transcription. Cet élément est indispensable pour obtenir un niveau basal de transcription. Le motif E est reconnu par des facteurs de transcription contenant des domaines de liaison à l’ADN de type hélice-boucle-hélice et leucine zipper. Parmi ces facteurs de transcription, on trouve les protéines MYC et USF. Le gène PIGR est exprimé dans les cellules intestinales différenciées qui produisent USF et généralement réprimé dans les cellules tumorales de cancer colorectal qui sur-expriment MYC. Ces observations ont permis d'émettre l'hypothèse que les facteurs USF et MYC pourraient reconnaître l’élément E et agir de manière opposée sur l’expression de PIGR. Les expériences suivantes ont été réalisées pour tester cette hypothèse.-A) retard sur gel (figure 1).
B) transfections (Figure 2).
Le promoteur du gène PIGR contenant le motif E est inséré dans un plasmide en amont du gène de la luciférase (plasmide WT-PIGR). Le plasmide est co-transfecté dans des cellules intestinales avec un plasmide codant les facteurs USF ou MYC. 24h après transfection, l’activité luciférase est analysée (figure 2).
-C) immuno-précipitation de chromatine (figure 3). Des cellules en culture sont traitées par la formaldéhyde (induit un pontage covalent ADN-protéines). La chromatine est alors isolée et immunoprécipitée avec des anticorps antiMYC, anti-USF ou anti-histone H4 acétylée. L’ADN est extrait de la chromatine immunoprécipitée et soumis à PCR avec des amorces spécifiques du promoteur du gène PIGR (la taille attendue est de 205 bp). Le