Sous clonage du promoteur de Gabarapl1 dans un vecteur reporter Luciférase pGL3

Pages: 26 (6443 mots) Publié le: 5 janvier 2015
Rapport scientifique:




Sous clonage du promoteur de

Gabarapl1 dans un

vecteur reporter Luciférase pGL3











Résumé


Lors de cette expérience, nous avons réalisé un clonage. De nombreuses manipulations ont été effectuées. D'abord nous avons préparé l'insert et le plasmide, que nous avons ligaturé. Les bactéries ont ensuite été renduescompétentes avant qu'elles ne soient transformées par le plasmide recombinant. Enfin ; nous avons procédé à l'analyse de notre produit de clonage.


Introduction

Le travail réalisé lors de ce TP aura pour but la réalisation d'un clonage, c'est à dire l'insertion d'un fragment d'ADN contenu dans un vecteur initial dans un autre vecteur puis la transformation de ce plasmide recombiné dans lesbactéries E-Coli. La transformation consiste à introduire un plasmide par choc thermique, électroporation ... dans une bactérie afin d'obtenir des clones de bactéries recombinantes qui seront par la suite analysés. Ainsi les bactéries transformées disposeront de nouvelles protéines qui leurs seront bénéfique ou non pour leur développement.
Ici, nous travaillons avec le fragment d'ADN Gabarapl1 duplasmide pJET qui est introduit dans le vecteur reporteur Luciférase. Les manipulations et techniques utilisées sont expliquées dans un premier temps puis les résultats seront exposés et discutés. Enfin nous réaliserons une conclusion sur ce travail.



Matériel et méthodes

L'ensemble des manipulations ont dû être soigneusement réalisées afin d'obtenir des résultats cohérents qui pourront êtreanalysés et commentés par la suite. De nombreux tests ont été réalisées pendant les manipulations pour confirmer la présence de l'insert ou du vecteur à ces moments précis, notamment des électrophorèses. Nous allons donc détailler dans ce paragraphe les étapes précises de l'expérience.


PCR (polymerase chain reaction)


Pour réaliser l'amplification, le milieu réactionnel doit contenir1µL de plasmide pJET contenant l'insert, 0,4 µL d'amorce sens de Sac I (gec1 cis577ss), 0,4 µL d'amorce reverse Hind III (gec1 cis577rev). Un tampon d'amplification contenant du chlorure de magnésium est indispensable à la réaction c'est pourquoi 5µL doivent être ajoutés tout comme 20Μ de nucléotides. La cuve est ainsi complétée avec de l'eau (39µL) pour obtenir un volume final de 50µL. Enfin0,04 unité de Taq polymérase doivent être introduits au dernier moment.
Un deuxième tube doit également être réalisé afin de réaliser un test contrôle pour la suite. Ainsi celui-ci doit contenir les divers éléments cités ci-dessus mais sans matrice d'ADN. Par conséquent un volume d'eau doit être ajouté en plus pour combler le manque soit 40µL.
Par ces procédés, la PCR est prête et sur une duréetotale de 1h30.


Contrôle de la PCR par électrophorèse


Dans un premier temps, il est nécessaire de préparer le support de l'électrophorèse, pour cela, 1g de saccharose doivent être mis à ébullition avec 100mL de tampon TAE 0,5X. Après refroidissement, ce mélange a été introduit dans le moule de l'électrophorèse sur une épaisseur d'environ 0,5cm et sans oublier de placer les bandelettesqui laisseront place une fois sec aux puits.
Pendant ce temps, les deux tubes de la PCR sont préparés c'est à dire que nous avons introduit dans chacun 1µL de tampon de charge ADN 6X qui contient 0,40µL de saccharose et 0,0006µL de bleu de bromophénol).
Ainsi les deux solutions ont été introduites dans deux puits distincts puis l'électrophorèse a été mise en fonctionnement sur 100V pendantenviron 30 minutes. Les résultats sont exposés et commentés par la suite.


Digestion du plasmide pJET contenant l'insert : gabarapl1

Nous avons ajouté dans un tube Eppendorf de contenance 1,5mL, 15µM d'acétate de sodium puis 100µL d'éthanol absolu. Après avoir bien mélangé le mélange, la solution a été placée 10 minutes dans la glace puis placée 10 minutes à la centrifugeuse à 10 000g,...
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