TP Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)
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TP CPGBSF – L3 Biochimie
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CPG
La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) est une technique de séparation des molécules d’un mélange. Il s’agit d’une chromatographie de partage gaz-liquide. Le critère de séparation est l’affinité respective des molécules à séparer avec les phases stationnaire et mobile. Les composés doivent être volatils pour être séparés, on va donc dériver les produits de l’hydrolyse afin qu’ils soient volatils.
La phase mobile est un gaz de faible viscosité qui entraîne les composés à séparer tout au long de la colonne. On peut utiliser l’azote, l’hydrogène ou l’hélium. Le gaz circulant de manière continue l’équilibre entre les molécules et la phase stationnaire est constamment perturbé, les molécules migrent donc d’une part en fonction de leur affinité et d’autre part en fonction du temps à des vitesses caractéristiques.
La phase stationnaire est un polymère liquide à haute température, dans notre cas il s’agit de
Poly(25%-cyanopropyl-75%diméthylsiloxane) qui est apolaire et hydrophobe (indice de polarité de
1813).
cyanopropyl
(poly)diméthylsiloxane
Le gaz vecteur est introduit dans la colonne par un injecteur en mode split, ce qui permet d’ajuster, à l’aide d’une vanne, la quantité de produit passant dans la colonne par rapport à celle injectée dans le chromatographe. Ainsi on obtient des pics nets sur le chromatogramme.
La colonne utilisée est une colonne capillaire d’un diamètre de 250 µm et d’une longueur de 15 mètres. Cette longueur est nécessaire à la séparation des molécules en raison de la forte expansion des volumes des molécules à haute température, malgré le faible volume injecté (1 µL).
Cette colonne est localisée dans un four permettant de maintenir une température élevée (200°C à
220°C).
En fin de colonne, les molécules passent devant le détecteur à ionisation de flamme (FID) : les molécules sont brûlées par une flamme alimentée en hydrogène et air, ce qui permet la formation d’ions qui sont