Tp enzymologie phosphatase alcaline
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ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINEET
DÉTERMINATION DU pH OPTIMUM
BUT: Connaître les caractéristiques de la phosphatase alcaline tels que la Vm, le Km et le pH optimum.
Lors de ce T.P. On étudiera donc les propriétés phosphatase et alcaline de cette enzyme. Une phosphatase est une enzyme qui hydrolyse un monoester phosphorique et forme un phosphate et un alcool ou un phénol:
R-O-PO32- + H2O → R-OH + HPO42- Pour connaître le Vm et le Km de cette enzyme, on a besoin d'étudier sa cinétique: on dosera par spectrométrie les produits apparus en présence de différentes quantités de substrats connus. Et pour connaître son pH optimum on dosera, toujours par spectrométrie, les produits apparus en présence d'une quantité fixe de substrats dans différents milieux alcalins de pH connus.
Cette enzyme est très présente dans certains tissus comme les tissus osseux, muqueuse intestinale. On utilisera donc une phosphatase alcaline de mucus intestinal de veau.
I.Étude cinétique
Lors du dosage on utilisera comme substrat le p-nitrophényl phosphate (PNPP) qui est hydrolysé par la phosphatase alcaline en p-nitrophénol (PNP) qui est jaune en milieu alcalin: le PNP a une absorbance maximum à 410 nm.
O2N- -O-PO32- + H2O → O2N- -OH + HPO42-
La densité optique (D.O) de la solution à 410 nm est donc proportionnel à la quantité de PNP présents, donc proportionnelle à la consommation de PNPP. On aura besoin de faire une gamme étalon à partir de quantités de PNP connues pour connaître la correspondance entre la D.O et la quantité de PNP.
On dispose comme produit de:
Tampon Tris-HCl 0,1M ph 8,3 qui permet uniquement de maintenir un pH=8,3
PNPP 5mM (185mg/100mL)
PNP 0,5mM (7mg/100mL) utilisé pour la gamme étalon
Zn Cl2 0,6mM (82mg/L) qui permet à l'enzyme d'avoir les 4 ions bivalents phosphatase alcaline 0,1mg/mL (50unités/100mL)
N.B: Toutes les mesures et les manipulations se font à 37°C, température