Tp immunologie elisa

Pages: 8 (1776 mots) Publié le: 16 février 2012
BIO49 TP d’immunologie

Titrage d’un sérum de lapin par test ELISA

Manipulation : Cette manipulation permet de mettre en évidence la présence d’anticorps spécifique anti-BSA dans le sérum de lapin immunisé à cette antigène et de quantifier ces anticorps par le test ELISA, une technique immunoenzymatique.

Le test ELISA consiste à fixer sur les parois des puits de la plaque ELISA desantigènes en excès (antigène=BSA= Sérum albumine Bovine), afin de monopoliser totalement les parois des puits, ce qui empêche la fixation d’autres protéines. Afin d’enlever les antigènes non absorbés on effectue un lavage. Par la suite on ajoute les anticorps primaires par injection du sérum immunisé contre cet antigène dans les puits. On refait un lavage pour éliminer les anticorps non fixés sur lesantigènes ainsi que d’éventuelles protéines contenues dans le sérum. On ajoute les anticorps secondaires qui sont préalablement couplés avec des enzymes, qui sont actifs seulement dans un pH alcalin, et qui sont dirigés vers les anticorps primaires, puis on lave les puits afin d’éliminer les anticorps secondaires non fixés. Enfin, on ajoute le substrat complémentaire à l’enzyme afin de mettre enévidence les anticorps secondaires, liés aux déterminants isotypiques des anticorps primaires, fixés sur le complexe protéique comprenant l’antigène. De ce fait, on met en évidence les anticorps primaires spécifiques à la BSA.

Méthode d’expérimentation :

Tout d’abord, le sérum immunisé contre la BSA contient plusieurs types d’anticorps dirigés contre cet antigène qui se fixent chacun sur unépitope spécifique de la BSA : ce sont les anticorps polyclonaux.
De ce fait, afin de diminuer la quantité d’anticorps contenus dans le sérum immunisé, on effectue des dilutions dans 48 puits différents d’une plaque de dilution qui ne fixe pas les protéines et ne perturbe donc pas la quantité d’anticorps voulu.

On effectue des dilutions en cascade car on ne possède pas le matériel approprié (levolume minimum qui peut être prélevé par les micropipettes est de 1 µl) pour faire des dilutions aussi précises. On effectue des dilutions allant de 1/10 000 au 1/1 280 000.
On transfère les solutions diluées dans une plaque ELISA, spécialement adaptée au test ELISA et qui a la caractéristique de fixer n’importe quelle protéine ( c’est pourquoi nous avons mis de l’antigène en excés).

Le sérumutilisé provient d’un lapin préalablement immunisé par la BSA. Il est constitué d’anticorps polyclonaux complémentaires à l’antigène. Ils feront office d’anticorps primaires dans ce test ELISA. Un autre sérum provenant d’un lapin non immunisé est utilisé comme témoin négatif pour l’expérience. Par la suite, on utilise de l’immunoglobuline de chèvre anti-anticorps de lapin comme anticorpssecondaires. Cette protéine est couplée à l’enzyme phosphatase alcaline qui, lorsqu’on ajoute le pNPP (para-Nitro Phényl Phosphate), qui est le substrat, et que celle-ci est activée, va interagir avec son substrat avec une coloration jaunâtre et va donc mettre en évidence le complexe étudié.
Le substrat est toxique et réagit rapidement avec la lumière, c’est pourquoi nous enveloppons les tubes ouconteneurs comprenant le substrat avec de l’aluminium pour limiter l’incertitude dans les résultats.

De plus, on quantifie le nombre d’anticorps dans quatre fractions numérotées de F1 à F4 qui sont issues de la purification du sérum immunisé par chromatographie d’affinité. Chaque fraction est diluée en double au 1/10000puis au 1/20000.

Comme on l’a dit auparavant, on effectue plusieurs lavages afind’éliminer les protéines qui
ne se sont pas fixées. Pour cela, on prépare un détergent non ionique (qui ne dénature donc pas les protéines étudiées), le Tampon PBS-Tween 0,05%, avec du PBS 10x initial et du tween20 pure. Ce détergent est aussi utilisé pour diluer les différents sérums.

Enfin, pour titrer les anticorps, on mesure l’absorbance des solutions a l’aide d’un spectromètre qui...
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