I. Introduction

Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme afin d’étudier l’influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur sur la vitesse de réaction.

Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline de veau. Il s’agit d’une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d’hydrolyser les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante :

R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2-

II. Principe

Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotométrique des produits apparus dans le milieu, lorsque l’enzyme est en présence de son substrat. Pour faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP) qui, après action de l’enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP) directement dosable à 410nm.

+ H2O HPO42- +

PNPP incolore PNP coloré

Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l’absorbance d’une substance colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d’enregistrement
(ordinateur), qui nous permet de visualiser l’évolution de l’absorbance dans un intervalle de temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâce à la pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (.DO/min).

De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gamme étalon de tubes contenant différente concentration (connues) de produit. On trace la droite

2FigPart2
DO = f ([PNP]). En reportant l’absorbance d’une solution de concentration inconnue, on peut en déduire sa concentration.

III. Manipulations préliminaires

Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d’incubation, nous devons préalablement préparer les solutions de substrats de concentrations