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Tp phosphatase alcaline

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BCH2008L Enzymologie et Métabolisme ___________________________________________________________________

ETUDE CINETIQUE ET DETERMINATION DU pH OPTIMUM DE LA PHOSPHATASE ALCALINE
Les phosphatases ou phosphomonoestérases sont des enzymes qui hydrolysent les monoesters phosphoriques avec formation de phosphate minéral et d'un alcool ou d'un phénol, selon la réaction : R-O-PO32- + H2O  R-OH + HPO42-

Méthodologie
La manipulation permet l'étude de l'influence de plusieurs facteurs sur la réaction enzymatique. L'enzyme utilisée est une préparation commerciale partiellement purifiée de phosphatase intestinale de veau, la réaction sera suivie en dosant les produits apparus dans le milieu lorsque l'enzyme est mise en présence du substrat. Pour des raisons de commodité, ce dernier est le p-nitrophényl phosphate (PNPP), composé incolore qui libère par hydrolyse du p-nitrophénol (PNP) jaune en milieu alcalin et dosable directement par spectrophotométrie à 410 nm.

NO2

OPO32-

H2O

NO2

OH

HPO42-

PNPP incolore

PNP jaune λ max= 410 nm

La densité optique de la solution à 410 nm est proportionnelle à sa consommation en PNP, une gamme étalon établie à partir de concentrations (ou quantités) connues de PNP permettra de connaître la correspondance entre la concentration (ou quantité) de PNP et la DO, et donc de déduire de la DO lue la concentration (ou quantité) de PNP apparue dans le milieu réactionnel. Dans le cas d'essais enzymatiques, un blanc devra être réalisé en remplaçant l'enzyme par un volume d'eau équivalent, afin de tenir compte de l'hydrolyse spontanée du PNPP. L'utilisation d'un substrat chromogène, tel que le PNPP, permet d'éliminer le recours à une réaction auxiliaire pour doser les produits formés, ce qui serait le cas si on voulait suivre par exemple la libération de phosphate minéral dans le milieu.

Matériel et produits
Matériel : Bain thermostaté à 37°C Chronomètre Spectrophotomètre à 410 nm relié à un ordinateur Agitateur Vortex

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