Absorbance

| 3 | 3,5 | Absorbance à 415nm | 0.085 | 0.098 | 0.117 | 0.141 | 0.166 | 0.189 | 0.212 | 0.236 | Temps (minutes) | 4 | 4,5 | 5 | 5,5 | 6 | 6,5 | 7 | 7,5 | Absorbance à 415nm | 0.259 | 0.278 | 0.301 | 0.322 | 0.341 | 0.360 | 0.379 | 0.396 | Temps (minutes) | 8 | 8,5 | 9 | 9,5 | 10 | 10,5 | 11 | 11,5 | Absorbance à 415nm | 0.413

Ainsi pour une longueur d’onde donnée, l’absorbance totale de la solution sera égale à la somme des absorbances relatives à chaque composé x et y. Pour un composé X à la longueur λx=λmax : Aλx =A’λx + A’’λx Pour un composé Y à la longueur λy=λmax : Aλy =A’λy + A’’λy Donc d’après la loi de Beer-Lambert : Aλx = Ɛ’x. l. Cx + Ɛ’y. l. Cy Aλy = Ɛ”x. l. Cx + Ɛ’’y. l. Cy A= absorbance sans unité. Ɛ= correspondant au coefficient d’extinction molaire de l’élément considéré en L/cm

associe A. Afin de vous familiariser avec les 3 onglets : Solution / Spectrophotomètre / Graphe, cliquer sur Exercices et choisir la rubrique Prise en main. S’entraîner en traitant les paragraphes 1, 2 et 3 de cette rubrique. Exercice 1 : Absorbance et concentration L’objectif de cet exercice est d’établir et d’utiliser la relation entre l’absorbance et la concentration d’une solution donnée. On utilise une cellule de longueur  = 1,0 cm pour mesurer l’absorbance d’une solution de sulfate

à 2000 rpm (basse vitesse), toujours en équilibrant les masses. On lit ensuite l'absorbance donnée par le spectrophotomètre, de chaque tube, à 650 nm, en prenant le tube 1 comme zéro. III – 3 : Résultats On obtient donc les résultats des absorbances à 650 nm (cf tableau 1 et tableau 2 voir annexe). Pour les 6 premiers tubes, le phosphate n'était apporté que par la solution de KH2PO4, on a donc pu en conclure les résultats de la colonne « phosphate μmol/tube » dans le tableau 1, le premier

l’alanine afin de déterminer la masse d’alanine à l’aide d’une gamme étalon. • Dosage spéctrophotométrique avec gamme étalon La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative permettant de doser une substance en mesurant son absorbance. L’absorbance mesure la capacité d’un milieu à absorber la lumière qu’il traverse. Le spectrophotomètre va analyser l’énergie lumineuse réfléchie ou transmise d’une solution. Si la solution absorbe dans le domaine du visible (400- Composé pourpre

14h30 322,5 1/10 32,25 15h30 615 1/10 61,5 16h30 905 1/10 90,5 17h00 1040 1/20 52 17h30 1110 1/20 55,5 Inoculum 1000 levures par rectangles soit 1000.10^8 levures par litre ou 10.10^10 levures par litre Absorbance à 600nm Heures Absorbance dilution Chiffre sans prendre T0 0,115 compte de la dilution 10h30 0,179 11h30 0,253 12h30 0,4 13h30 0,462 14h30 0,716 1/2 0,358 15h30 0,92 1/2 0,46 16h30 2,1 1/10 0,21 17h00 3,58 1/20

minutes à la température du laboratoire. Lire les absorbances à 530 nm contre le témoin réactif ou blanc (tube 0). 2. COURBE [P] = f(t) On opère en présence d'enzyme et de substrat à concentration constante, en milieu tamponnée pH=4,7 et thermostaté à 30°C. On fait varier le temps de contact entre substrat et enzyme en respectant le protocole suivant: Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à la température du laboratoire. Lire les absorbances à 530 nm contre le tube 0 (incubation 0 min).

cytochrome c (deuxième pic). Composé SAB Cytochrome c V1 (volume d’apparition en mL) 20,5 23,5 V2 (volume d’éluant contenant le composé en mL) 7,2 11   Ve (volume d’élution en mL) 24,1 35,7 Absorbance 280 nm Absorbance 409 nm Rapport 409/280 SAB de référence (0,3 mg/mL) 0,365 0,069 0,19 SAB X 0,268 0,031 0,12 Cytochrome c de référence (0,1 mg/mL) 0,326 0,445 1,36 Cytochrome c X 0,147 0,308 2,090 Dosage colorimétrique Réactifs

0 1 3 Homogénéiser, boucher les tubes avec du papier aluminium et porter 5 min exactement au bain marie bouillant. Laisser refroidir Ajouter : Eau distillée (ml) Homogénéiser et laisser reposer 10 minutes à température ambiante. Lire les absorbances (DO) à 540 nm contre le témoin (tube 0). 6 Résultats : - Tracer la courbe d'étalonnage DO = f (nombre de moles de sucre inverti en µM/tube). - Déterminer l'équation de cette droite d'étalonnage (faites vos calculs sur Excel 2003) Remarque

manipulation. Ici le manipulateur a utilisé des solutions commerciales Commenté [CT25]: Compiles les résultats obtenus en salle de TP directement par lecture sur de la verrerie (volume ajouté lors d’une titration), grandeur mesurée sur un appareil (absorbance, pH…)... Commenté [CT26]: Quatrième façon de citer un objet : ci- dessus, ci-dessous 5. Interprétation et exploitation des résultats a) Gamme