Bactéries Compétentes

TP de génie génétique Transformation de bactéries rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium Puis la préparation et l’analyse d’ADN plasmidique Transformation d'E.coli rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium Principe 1) préparation des cellules compétentes Avant le début du TP, les cellules à traité ont été préalablement mis culture jusqu’à leur phase exponentielle de croissance, car dans cette phase les cellules sont en division ce qui facilitera

inverse. 1. 1. Préparation d'une banque d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction : banque d'ADN génomique. Préparation de l'ADN. Les enzymes de restriction (voir polycopié introduction au génie génétique) sont des nucléasse purifiées à partir de bactéries qui coupent l'ADN au niveau de séquences spécifiques de 4 à 8 nucléotides, produisant des fragments d'ADN de tailles strictement définies, les fragments de restriction. Les enzymes de restriction sont utilisées pour produire de petits fragments

et Sélection des bactéries transformées a) transformation de bactéries ………… ………………………………… b) Sélection des bactéries transformées ……………………………. B. Transformation et Sélection de plantes transgéniques avec la construction que l’on vient de réaliser …………………………… 1. Transformation des Agrobacterium tumefaciens ……………………………… a) Introduction : les Agrobacterium tumefaciens et leurs modes d’action. b) Transformation d’agro bactéries électro compétente ………………………

correspondant sur les spectrophotomètres. Résultats Tracer les trois courbes de croissance (DO = f (t)) sur papier semi-logarithmique Déterminer les paramètres de la croissance. Conclure. b) Numération bactérienne Pour connaître le nombre de bactéries de la culture, on procède à l'étalement sur milieu gélosé LB de la suspension. On ne peut pas compter plus de quelques centaines de colonies : il faut donc effectuer des dilutions sérielles. 1) Prélever stérilement 100 μL de la culture mère d'E

PREPARATION DES BACTERIES COMPETENTES Protocole n° 1’ Chaque binôme dispose d’un erlenmeyer qui renferme 50 mL d’une suspension de bactéries cultivées sur un milieu favorable à leur croissance. A cette étape, il faudra manipuler dans des conditions stériles et le plus souvent à 0 °C. Prendre une boite en polystyrène et la remplir de glace pilée récupérée dans la réserve de glace. 1. Prélever stérilement 1 ml de suspension de bactéries et effectuer au spectrophotomètre

fragments afin d’obtenir des plasmides recombinés. C es derniers ont été introduits dans des bactéries thermo-compétentes pour le clonage. Afin de bien vérifier la réussite des pratiques, la culture des bactéries transformées est faite dans un milieu contenant de l’ampicilline et du X-gal. Les électrophorèses permettent alors de déterminer la taille du plasmide et de l’insert lors de la digestion et des bactéries transformées. Toutefois les résultats théoriques ne sont pas souvent obtenus. INTRODUCTION

que nous avons ligaturé. Les bactéries ont ensuite été rendues compétentes avant qu'elles ne soient transformées par le plasmide recombinant. Enfin ; nous avons procédé à l'analyse de notre produit de clonage. Introduction Le travail réalisé lors de ce TP aura pour but la réalisation d'un clonage, c'est à dire l'insertion d'un fragment d'ADN contenu dans un vecteur initial dans un autre vecteur puis la transformation de ce plasmide recombiné dans les bactéries E-Coli. La transformation consiste

insérer un fragment d'ADN (dénommé insert) dans un vecteur approprié comme un plasmide par exemple (voir exp4 pour une explication sur les plasmides). Le nouveau plasmide ainsi créé sera ensuite introduit dans une cellule hôte, en générale la bactérie Escherichia coli. Celle-ci sera alors sélectionnée et multipliée afin d’obtenir une grande quantité du plasmide d’intérêt. Cloner un gène consiste donc à l’insérer dans un plasmide. Un clone sera le transformant bactérien qui contient ce plasmide

l'isolement d'un fragment recherché, son insertion, sa multiplication, son extraction,.. Nous allons exposer dans les parties suivantes, les différentes étapes et leur importance. Résultats : Utilisation d'un vecteur de clonage : Les bactéries possèdent de petites molécules d'ADN circulaire : les plasmides. Les plasmides ont obligatoirement une origine de réplication, ils peuvent donc se répliquer de manière autonome, ils ont également des séquences courtes reconnues par des enzymes de

infection. L’injection d’un mélange de pneumocoques S ébouillantés et de pneumocoques R vivante entraine la mort de la souris par pneumonie. On retrouve dans les souris mortes des bactéries vivantes de type S. Un facteur en provenance des bactéries S pathogènes est capable de transformer les bactéries R inoffensives en bactéries S pathogènes. Il y a eu transfert de phénotype. http://www.arnobio2.com Arnaud Delahaye 1.2.2. Identification du principe transformant : Dans un premier temps, des extraits