Déshydrogénase

I- But : Le but de ce TP est d’obtenir l’isocitrate déshydrogénase (IDH) par voie recombinante. On utilise comme système d’expression E.coli (souche JM109) transformé par le plasmide pGEX-2T dans lequel on a inséré le gène de l’IDH. L’IDH recombinante exprimée est en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à des fins de purification par chromatographie d’affinité sur une colonne glutathione sepharose 4B. L’IDH peut être étudiée et dosée après clivage de la protéine de fusion par la thrombine

mitochondries (F3), l’ensemble du système endomembranaire (F4) et le cytosol contenant les protéines solubles (F5). Lors du TP, les différentes fractions ont été soumises à différents dosages d’activités enzymatiques telles que l’activité de lactate déshydrogénase, l’activité de la glucose-6-phosphatase, l’activité de la cytochrome C oxidase. Ces dosages nous ont permis de mettre en évidence la localisation subcellulaire de l’enzyme dosée. Ce TP nous a permis de définir ce qu’est une enzyme marqueur

 La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme tétramérique catalysant la conversion réciproque du pyruvate et du lactate accompagnée de la conversion simultanée du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de deux types de sous-unités différents M et H, et pouvant s'associer en cinq isoenzymes différentes. Le but de ce TP est de purifier la LDH, ici de façon partielle, au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne. Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur

LA LACTATE DÉSHYDROGÉNASE La lactate déshydrogénase ou LDH est une enzyme qui catalyse la réaction suivante : L-lactate + NAD⁺ <==> pyruvate + NADH + H⁺ Cette réaction permet pour la plupart des mammifères et des bactéries de faire de la fermentation lactique soit la réoxydation des cofacteurs (ici NADH,H⁺) en anaérobiose. Objectif : L'objectif de ce travail pratique est de purifier une protéine, en l'occurrence la LDH mais de façon partielle à partir d’un extrait cellulaire

en le cétose Fructose-6-Phosphate (voir diagramme). 2. Phosphofructokinase (PFK) Transfert d'une groupement phosphoryl de l'ATP a Fructose-6-Phosphate pour donner de l'ADP et le Fructose-1,6-bisphosphate. ii. L'enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) catalyse la conversion du Glucose-6-phosphate en oxydant le groupement aldéhyde en acide (le produit s'appelle 6phosphogluconate) en utilisant du NADP+ comme accepteur d'electrons. Désignez cette réaction. (4 points) Glucose-6-Phosphate

fait intervenir le glutathion qui doit être régénéré constamment par la glutathion réductase suivant le schéma suivant : GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+ La maladie métabolique connue sous le nom de favisme ou déficit en glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) entraine un déficit cellulaire en NADPH. Ceci résulte du déficit en G6PDH qui catalyse la première étape de la phase oxydative de la voie des pentoses. Elle conduit en particulier à une hypersensibilité au stress oxydant. Voir aussi

et organisation du retour à domicile des mères et de leurs nouveau-nés Abréviations et acronymes BS .......... Bilirubine sanguine BTC........ Bilirubinémie transcutanée G6PD ..... Glucose-6-phosphate déshydrogénase HTA........ Hyper-tension artérielle MCAD .... Acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaîne moyenne PMI ........ Protection maternelle et infantile PRADO… Programme d’accompagnement du retour à domicile SA .......... Semaine d’aménorrhée HAS / Service des bonnes pratiques

2008;371:64-74 IFMT. M. Strobel, 2008 1 Une cause d’anémie hémolytique héréditaire Corps de Heinz anémie hémolytique crises aigues Géographie, paludisme Infection Fèves médicaments IFMT. M. Strobel, 2008 2 L’enzyme Glucose 6 phosphate déshydrogenase ou G6PD • Rôle clé dans le métabolisme énergétique cellullaire : oxydo-réduction du glutathion pour la glycolyse (voie des pentoses) • L’enzyme présente une grande variabilité génétique : certains variants ( 140 mutations connues ) sont déficients

Bandelette urinaire Concentration en fer hépatique Cytomégalovirus Comprimés C-réactive protéine Crise vaso-occlusive Coefficient de diffusion du CO Diagnostic pré-implantatoire Diagnostic prénatal Électrocardiogramme Erythropïétine Glucose-6-phosphate déshydrogénase Globule rouge Haute Autorité de Santé Hémoglobine Hémoglobine S Chromatographie en phase liquide à haute performance Hypertension artérielle pulmonaire Human T-lymphotropic virus (rétrovirus) Inhibiteur de l’enzyme de conversion Interruption médicale

suite pour la production d’ATP • 1 GTP = 1 ATP 4 Pyruvate Les réactions du Cycle de Krebs NAD+ Pyruvate déshydrogénase NADH Acétyl-CoA Oxaloacétate 1-Citrate synthase NADH Citrate 2-Aconitase 8-Malate déshydrogénase Malate 7-Fumarase Isocitrate Cycle de l’acide citrique Fumarate FADH2 3-Isocitrate déshydrogénase NADH CO2 6-Succinate déshydrogénase 4-D-Cétoglutarate déshydrogénase 5-Succinyl-coA synthétase CO2 Succinate D-Cétoglutarate NADH 5 GTP Succinyl-coA Entrée du pyruvate