Dithiothréitol

protéines sont par ailleurs dénaturées en présence d’un détergent, le dodécyl sulfate de sodium (SDS) qui charge négativement les protéines; cette dénaturation s’accompagne d’un traitement avec un agent réducteur comme le β-mercaptoéthanol ou le dithiothreitol (DTT) de façon à rompre les ponts disulfure des protéines et dissocier les sous-unités. Le nombre de molécules de SDS fixées sur une molécule de protéine dépend de sa masse moléculaire (environ 1,3 g par gramme de protéine). MATERIEL - Tubes Eppendorf

Acylation de lysine (plus de 100 disponibles pour la conjugaison)  Réduction de cystéine & formation de thioether O O Cter Cter NH O NH O R4 peptide R4 R1 HN peptide R1 HN HS O S O S Nter O dithiothreitol SH Nter O 12 Les méthodes de conjugaison  3 principales :  Acylation de lysine (plus de 100 disponibles pour la conjugaison)  Réduction de cystéine & formation de thioether O O Cter NH O HN O Addition de

ont été réalisés : Traitement 1 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v) et urée 8 M. Traitement 2 : incubation de la protéine en présence de SDS 1% (p/v), urée 8 M et Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v). Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) Traitement 3 : incubation de la protéine en présence du Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v), uniquement. 1. Rappeler le rôle des composés : SDS, DTT et urée. 2. Schématiser les profils électrophorétiques correspondant à chaque traitement de la protéine. Justifier

n’existant pas dans les protéines natives. De ce fait on ajoute des agents réducteurs dans le tampon pour éviter ce phénomène. Le β mercaptoéthanol : HS–(CH2)2–OH (il faut deux molécules de β mercaptoéthanol pour réduire un pont dissulfure). Le dithiothréitol (DTT) : Le blocage des fonctions thiols est également nécessaire pour que les ponts dissulfures ne se reforment pas, ce blocage est réalisé de deux façons : La S Carboxylation : (avec l’iodoacétate : ICH2COO- ) La Cyanoéthylation : (avec

l’héparine. L’activité de l’α-chymotrypsine sera arrêtée par addition d’un inhibiteur des protéases à sérine, le PMSF (phénylméthylsulfonyl-fluoride). Ensuite une dénaturation de l’enzyme par la température en présence d’un agent réducteur (DTT, dithiothréitol) sera effectuée. Ces étapes sont nécessaires pour que la chymotrypsine soit irréversiblement inactivée et qu’ainsi, la protéolyse ne puisse pas continuer au cours des essais de fixation à l’héparine. Produits : - l’α-chymotrypsine 0,2 mg/ml, le

purification et les essais d’activité in vitro ont été conduits en anaérobiose stricte. Les tampons sont préparés à partir d’eau distillée gazée sous un courant continu d’azote; ils contiennent 100 mg de dithionite de sodium et 100 mg de dithiothreitol par litre. Les éluats des colonnes sont recueillis dans des erlens gazés à l’azote. Les fractions protéiques sont manipulées au moyen de seringues connectées à des tubes en chlorure de polyvinyl. Préparation et purification

incubées avec la trypsine pendant 5 min à 37°C. Les cellules sont récoltées, par la suite, dans des eppendorfs et centrifugées 5 min à 3000 rpm, le colot est suspendue dans 400 µl de tampon de lyse contenant 8M d’urée, 1 M de Tris pH 6.8, 0,1 M de dithiothreitol (DTT) du SDS 20% et un cocktail d’inhibiteur de protéases et laisser agir 10 min sur glace. Les échantillons sont soumis à sonication pendant dix secondes à la puissance minimale. Pour la détection des protéines par Western blot en ajout

d’ARN purifié, de la RNaseOUT (inhibiteur d’ARNase) et d’oligonucléotides aléatoires sont nécessaire. Un tampon adéquat doit aussi être utilisé (constitué de KCl pour favoriser l’hybridation, de Tris pour maintenir un pH adéquat, de MgCl2 et de dithiothreitol).Après, une PCR à partir des ADNc précédemment obtenue est faite.L’ADNc est utilisé comme matrice avec les amorces sens et antisens préalablement construites. Un tampon spécifique est nécessaire, avec, comme composition du Tris, pour le pH, du

Bovine Serum Albumine: sérum albumine bovine Ca : calcium Composé résorcinolique : CR DAPI: Di Amino Phényl Indol DFO: Deferoxamine mesylate salt DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO: DiMéthyl sulfOxide DTT : réactif de Cleland : dithiothréitol EDTA: Ethylène Diamine Tétra Acétique EGF: Epidermal Growth Factor: facteur de croissance de l’épiderme g : gramme H₂O2: péroxyde d’hydrogène HBSS: Hank's Buffered Salt Solution IL: Interleukines IL1-R: IL1 recepteurs KSFM: Keratinocytes

Dichlodihydrofluorescein Diacetate, Acétyl Ester CMX Rosamine : Chlorométhyl-X-Rosamine CuSO4 : Sulfate de cuivre DCPIP : 2,6-dichlorophenolindophenol DMEM : Milieu modifié de Eagle Dulbecco DMSO : Diméthylsulfoxide DO : Densité Optique DTT : Dithiothréitol EDTA 2Na 2H2O : Acide Ethylenediaminetetraacetique disodique EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique EGTA : Acide éthylène glycol tetraacetique ERO : Espèces Réactives de l'Oxygène EtOH : Ethanol FAD : Flavine Adénine Dinucléotide