Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Passage de l’électrophorèse sur gel à l’électrophorèse capillaire Dr Maurice Schmidt ADMED Analyses et diagnostics médicaux Neuchâtel-La Chaux-de-Fonds www.admed-ne.ch L’électrophorèse, une longue histoire de supports •  •  •  •  •  •  •  •  En veine liquide (Tiselius 1930) Papier filtre (membrane) Acétate de cellulose (membrane) Amidon (milieu gélifié) Agar-agar (milieu gélifié) Agarose (milieu gélifié) Polyacrylamide (gel) Capillaire de silice (veine liquide, ∅ < 100 µm, l: 8 cm) www

points) Cette technique permet de contrôler la qualité du malt en vue de son utilisation en brasserie. Elle s'effectue par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Première dimension: isoélectrofocalisation (I.E.F.) en gel de polyacrylamide entre pH 2,5 et 7,0. Deuxième dimension perpendiculaire à la précédente : électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions non dénaturantes (P.A.G.E.). 2 1.2.1. Première étape : isoélectrofocalisation (document 3) (7 points)

vont être sélectivement retenus sur la colonne, tandis que les autres composants sont très rapidement élués. Un changement de la phase mobile (pH, force ionique…) permet ensuite d’éluer les substances d’intérêts. 1°) Purification partielle sur gel de bleu Cibacron de la LDH contenue dans un extrait tissulaire Fraction non retenue Fraction de lavage Fraction E1 Fraction E2 Fraction E3 2°) Mesure de l’activité enzymatique de la LDH dans les différentes fractions

Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe t'il une autre méthode pour déterminer la MM ? Correction exercice 1 : 1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps

séparés en gel d'agarose ou, si les fragments sont de petite taille, en gel de polyacrylamide. • Après dénaturation de l'ADN et transfert par capillarité ou par électrophorèse, sur des filtres de nitrocellulose ou de nylon à l’aide de la sonde spécifique l’ADN sera détecté. 1 - Après avoir digéré l'ADN à étudier par une enzyme de restriction, on obtient un mélange de très nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments à une électrophorèse pour les faire migrer dans un gel de haut

nucléotides sont normalement appairés A la fin de la réaction en chaine, les fragments d’ADN de différentes tailles sont formés a travers tout les tubes à essai. Le Gel Polyacrylamide Electrophorèse est utiliser pour séquencer l’ADN, on dispose le contenu des 4 tubes a essai( 1 de Guanine, 1 de Adénine ect…) en haut de la plaque de gel, dans la quelle on vas faire passer un courant L’ADN vas se déplacer du pole négatif(en haut) jusqu’au pôle positif ( en bas ), à cause de la charge négative transmise

λ2 (à 280nm)= 0.039 pour les protéines. Rapport = 1.789 Concentration = 0.071x 50 = 3.55 μg/ml Troisième Séance : Eléctrophorèse Sur Gel • Principe : Les protéines sont séparées en fonction de leur masse molaire par électrophorèse en présence de SDS sur gel de polyacrylamide de concentration uniforme dans un système à cuves verticales. • Methodologie : La Préparation du gel D’agarose à 1% : (1g agarose/ 100ml TBE ). TBE: tampon d’éléctrophorèse(Tris-borate-EDTA) Utilisé pour la migration éléctrophorique

d’ATP radioactif et de polynucléotide kinase. 2. Isolement du fragment d’ADN à séquencer. Celuici est séparé au moyen d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d’ADN est découpé du gel et récupéré par diffusion. 3. Séparation de brins: Les deux brins de chaque fragment d’ADN sont séparés par dénaturation thermique, puis purifiés par une nouvelle électrophorèse. 4. Modifications chimiques spécifiques: Les ADN simple-brin sont soumis à des réactions chimiques spécifiques des différents

lysozyme présent dans le blanc d’œuf grâce à une technique de chromatographie sur colonne de carboxyméthyl cellulose, échangeuse de cations ; puis de déterminer la présence de lysozyme par un test enzymatique et enfin, sa pureté, grâce à une électrophorèse. Matériel et méthode 1) Purification du lysozyme On récupère le lysozyme dans le blanc d’œuf (car il n’est pas présent dans le jaune d’œuf) par filtration sur gaze, puis sur papier filtre. Le filtrat obtenu constitue

leurs constantes cinétiques mais également par leurs pH isoélectriques, le monomère H étant le plus chargé négativement à pH neutre^ou alcalin. Cette dernière propriété est utilisée pour séparer les isoenzymes de la LDH par électrophorèse non dénaturante en gel de polyacrylamide. Au cours de cette manipulation, la purification partiellede la LDH sera effectuée par chromatographie d'affinité sur bleu Cibacron fixé par covalence sur une phase stationnaire poreuse. La structure du ligand est la suivante: