Extraction D Un Adn Plasmidique

Filière SVI – S6 Module de Génétique et Biologie Moléculaire Elément 2: Biologie Moléculaire TD N°1:TECHNIQUES DE SEPARATION ET D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES: ADN, ARN & PLASMIDES 2 TD1.TECHNIQUES DE SEPARATION ET D’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES 1.Purification des acides nucléiques 1.1.Extraction des ADN 1.2.Extraction des ARN 1.3.Extraction des 1.3.1. Rappel sur les plasmides plasmides 1.3.2. Purification par Lyse alcaline 1.3.3. Purification par Gradient de chlorure de césium 2.Séparation des

 PROJET DE FIN D’ETUDES Option : BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE (SVI) EXTRACTION D’ADN PLASMIDIQUE ET TRANSFORMATION D’ESCHERICHIA COLI PAR UN PLASMIDE Présenté par : •USANASE VIVENS Soutenu, le 28 Juin 2013

Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire Extraction et digestion de plasmide d’Escherichia coli Réaliser par: Fatima zahra

1. Extraction des protéines cellulaires 2. Electrophorèse en SDS-PAGE 3. Transfert sur membrane de nitrocellulose 4. Révélation et immunodétection II. Résultats et discussion D. Analyse de l’ADN recombinant I. Principes 1. Extraction d’ADN plasmidique 1. Digestion des plasmides 2. Séquençage par la méthode de Sanger II. Résultats et discussion 1. Gel 1: ADN plasmidiques non digérés

DIFFERENTES TECHNIQUES D’EXTRACTION D’ADN C. UTILITE DE L’EXTRACTION D’ADN CONCLUSION INTRODUCTION L'acide désoxyribonucléique (ADN) est une molécule, présente dans toutes les cellules vivantes, qui renferment l'ensemble des informations nécessaires au développement et au fonctionnement d'un organisme. Ainsi l’ADN est présent dans tout être animale ou végétale et son extraction permet de connaitre l’identité d’un être. Quels sont les différentes techniques de l’extraction de l’ADN et quelle est sont

morceaux de l’ADN du phage lambda dans le vecteur (plasmide) pBluesscript 8 Principe du TP Jour 1 HindIII EcoRI HindIII Vecteur (plasmide) EcoRI ADN génomique de lambda Première étape: Coupure de l’ADN génomique par une ou plusieurs enzymes de restriction et ligation des fragments obtenus dans un vecteur de clonage. Digestion Ligation ADN recombinant 9 Principe du TP Jour 1 Deuxième étape : Insertion des molécules recombinantes dans les bactéries hôtes par transformation

(chélateur de cations divalents). Le Tris-HCl pH 8 permet l’équilibration du pH. La dénaturation des protéines et de l’ADN plasmidique et génomique est induite par le SDS 1 % et NaOH. L’acétate de potassium et l’acide acétique pH 5,2 permettent la neutralisation de NaOH et la renaturation de l’ADN plasmidique. L’élimination des protéines est réalisée par la méthode classique des extractions sélectives au phénol-chloroforme, et le phénol éliminé par traitement au chloroforme. L’ADN est précipité par l’éthanol

cations divalents). Le Tris-HCl pH 8 permet l’équilibration du pH. La dénaturation des protéines et de l’ADN plasmidique et génomique est induite par le SDS 1 % et NaOH. L’acétate de potassium et l’acide acétique pH 5,2 permettent la neutralisation de NaOH et la renaturation de l’ADN plasmidique. L’élimination des protéines est réalisée par la méthode classique des extractions sélectives au phénol-chloroforme, et le phénol éliminé par traitement au chloroforme. L’ADN est précipité par l’éthanol

Amplification de l’ADN du gène ATPIF7 …………………. i. Dénaturation ………………………………………………………………. ii. Hybridation ou d’appariement des amorces ……………………………… iii. Élongation ……………………………………………………………… 2. Digestion et Ligature de l’insert (ADN PIF7) ……………………………. a) Digestion ……………………………………………………………… b) Purification ……………………………………………………………… c) Ligature ……………………………………………………………… 3. Transformation et Sélection des bactéries transformées a) transformation de

De TP realisé par: •Ramy Meouchy 60952 •Amer Choueib 61122 Première Séance: Extraction de l’ADN plasmidique Bactéries Utilisées : E.Coli dans un milieu de culture LB (boite de pétri contenant des bactéries ayant déjà subit la transformation). Les différentes étapes de l’expérience : a) Lyse des cellules bactériennes. b) Déproteinisation c) Enlèvement de L’ARN: traitement Rnase d) Précipitation de l’ADN But : ADN une fois extracté, on peut l’amplifier (PCR) , le doser , le séquencer ou le cloner