Fuchsine

TP3 : Antibiogramme a) Identification du gram de la bactérie b) But et principe Préparer sur lamelle une coloration des Grams à l’aide de plusieurs solution : du violet de gentiane, du lugol, de l’éthanol à 70% et de la fuchsine de ziehl. Cette manipulation a pour but de révéler le type de gram de l’échantillon à tester et de savoir si ces souches sont des bacilles ou des coccis grâce à une observation au microscope. c) Résultats Le test de coloration de Gram révèle une coloration rose. J’en

constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet. Réactifs : - Violet de gentiane phénique - Lugol (iodo-iodure de potassium) - Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone) - Safranine (ou Fuchsine phéniquée de ziehl) Mode opératoire : 1. Réaliser un frottis et le fixer à la flamme 2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute 3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir

minute ; • rincer à l’eau distillée les deux faces de la lame ; • décolorer dix secondes à l’alcool (face vierge d’abord puis frottis) ; • rincer immédiatement à l’eau distillée ; • plonger la lame dans la safranine (ou la fuchsine) phéniquée pendant 1 minute ; • laver la lame à l’eau distillée ; • sécher la lame en la tamponnant avec du papier Joseph ; • observer à l’objectif x100 à l’immersion (voit fiche technique n°1) La coloration au bleu de Méthylène

présentes dans le yaourt, les lactobacilles et les streptocoques. On veut trouver, s’ils sont à Gram positif, ou négatif. 2) Matériel Matériel biologique - yaourt Matériel chimique - alcool (95%) - violet de gentiane - Lugol - Fuchsine - Eau distillée - Huile d’immersion Matériel physique - Lame/lamelle - Ensemenseur - Cristallisoir - 2 bâtonnets en verre - bec Bunsen - microscope - pipette 3) Déroulement de l’expérience D’abord, on a préparé une lame avec des

spores dans certains types de bactéries. Pour cela, on utilise la méthode de Benito-Trujillo, cette méthode va permettre de colorer les spores en vert à l'aide du vert de malachite, le cytoplasme de la bactérie sera lui coloré en rose grâce à la fuchsine basique. Dessin d’observation d’un bacille Gram + avec un spore en position sub-terminale au microscope photonique (x1000) On observe des bacilles Gram + avec des spores en position sub-terminale, les spores sont de formes ovales et prennent

l’occasion des TP, nous réaliserons une variante, à froid, de cette coloration. En effet, le chauffage de la lame provoque un dégagement de phénol (toxique) et parfois l’éclatement de la lame. L’étape de coloration à la fuchsine se fera donc de la façon suivante : Recouvrir de fuchsine concentré pendant 5 minutes sans chauffer. Rincer à l’eau Les véritables éléments acido-résistants sont : les Mycobacterium, les spores bactériennes ou végétales, les anneaux de lignine, les grains de pollen et les

Compte Rendu ADRIEN BAC PRO BIT TERMINAL 2012/2013 Sommaire : * INTRODUCTION * IDENTIFICATION DES BACTERIES (COLORATION DE GRAM, état frais)  * Réalisation d’une dilution (10 -5). * Réalisation d’un ensemencement d’un milieu. * Réalisation d’un dénombrement microbienne dans une boite de pétrie. * Examen macroscopique des Cultures. INTRODUCTION ORIGINE DES MICRO-ORGANISMES PRESENTS DANS UN ALIMENT : Les micro-organismes des aliments ont 3 origines possibles :

William Henri Perkin en Angleterre. La mauvéine est un colorant anilique basique qui, en présence d’acide, ce colore en pourpre ( il n’est plus utilisé aujourd’hui ) . Trois ans plus tard, un chimiste ,Verguin , découvre la fuchsine, le deuxième produit colorants synthétique. La fuchsine, en raison de son insuffisance de résistance aux acides, ne joue également plus aucun role aujourd’hui. Ainsi les colorants synthétiques sont crées industriellement par l’Homme : soit ils sont des copies des colorants

séparés de ce mélange. - la chromatographie sur couche mince (CCM), qui est destinée surtout à la séparation en vue d’analyse d’un mélange. II - BUT On veut séparer et récupérer isolément les constituants d’un mélange de deux colorants : la fuchsine et le rouge de méthyle, puis les analyser. Ces substances ont l’avantage d’être colorées, ce qui permet de suivre facilement la séparation. La séparation s’effectue par chromatographie sur colonne et l’analyse par chromatographie sur couche mince

un mélange alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée. * Recoloration à la safranine ou à la fuchsine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes. Les bactéries gram + sont colorées en violet, les bactéries gram - sont colorées en rose, ceci étant