Plasmide Ti

o57 DATE: GROUPE de TD: 9 CLONAGE DE MORCEAUX D'ADN DU PHAGE LAMBDA Résumé: Lors de ce TP de BIO 57, nous allons réaliser des clones de morceaux d'ADN du phage Lambda. Pour cela on utilise des vecteurs de clonages (içi un plasmide pBluescript) combinés avec notre ADN à cloner, on a donc des molécules recombinantes ,ou ADNrecombinants (vecteur + ADN lambda). Ensuite on les introduit dans des bactéries hôtes afin de les reproduire. Au final on obtient des clones d'ADN lambda avec son

restriction Chapitre 11 : Expression 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 11.10 11.11 11.12 11.13 Vecteur (définition) Cellules-hôtes Cycle du phage λ Phage λ Clonage (I) Clonage (II) EMBL Polylinker Clonage directionnel Carte du plasmide pBR322 Carte des plasmides pUC18/19 Cycle de M13 Carte du M13 6/183 Biologie génique - Pr A. Raisonnier 2006 - 2007 Plan du cours 161 163 164 165 167 168 169 170 171 172 173 175 176 177 179 181 182 183 Partie IV : Le génie génétique Chapitre

ont été réalisées pour tester cette hypothèse. -A) retard sur gel (figure 1). B) transfections (Figure 2). Le promoteur du gène PIGR contenant le motif E est inséré dans un plasmide en amont du gène de la luciférase (plasmide WT-PIGR). Le plasmide est co-transfecté dans des cellules intestinales avec un plasmide codant les facteurs USF ou MYC. 24h après transfection, l’activité luciférase est analysée (figure 2). -C) immuno-précipitation de chromatine (figure 3). Des cellules en culture

être utilisée pour un clonage partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique, mais aussi pour le clonage pondant. L’insertion est souvent réalisée à l’aide d’un vecteur, le plus communément utilisé étant une molécule d’ADN appelé (plasmide). Et scientifiquement, c’est l’obtention d’un être vivant génétiquement identique au parent qui lui donne naissance. Il s’oppose donc à la reproduction qui nécessite deux parents. Toutefois, il ne fait pas confondre le clonage avec certaines

plus longs, relient deux bactéries et sont voies d'échanges de matériel génétique entre les bactéries. Les bactéries capables de produire des pili sexuels sont dénommées bactéries "mâles" à l'opposé des autres qui sont dites "femelles". Les plasmides Les plasmides sont de petits éléments circulaires constituant du matériel génétique extra-chromosomique. Ils sont faits d'ADN et portent, comme le chromosome, des informations génétiques. Ils sont autonomes et capables de se répliquer indépendamment du

humaine est obtenue par transgénèse bactérienne. Cette manipulation consiste à prélever le gène codant de l’insuline sur le chromosome d’un Homme (espèce donneuse) puis à l’insérer dans un plasmide (molécule d’ADN circulaire d’une bactérie distincte de l’ADN chromosomique, capable de réplication autonome). Ce plasmide « recombiné » est réintroduit dans la bactérie Escherichia coli (espèce receveuse). La bactérie Escherichia coli ainsi génétiquement modifiée peut, lorsqu’elle est mise dans des conditions

d’ADN étranger dans un vecteur -Digestion de l’ADN plasmidique -Déphosphorylation des extrémités 5’ du plasmide -Purification du fragment à intégrer -Ligation par une ligase + ATP -vérification par électrophorèse Clonage de bouts francs : + difficile Rendre les extrémités de l’insert et du plamide cohésives : + efficace 2 Il faut amplifier le vecteur recombinant c- du plasmide pBR 322 au phagemides, cosmides, BAC et YAC pBR 322 4000pb ; 1 origine de réplication ; 2 gènes de résistance

elles consistent surtout en maladies, cancers, gale, et même rapidement la mort. Le plasmide, qui est une petite molécule circulaire d’ADN, est mobile et peut passer d’une cellule à une autre. Certains plasmides peuvent alors s’intégrer au génome de la cellule hôte. Cette forme de transfert d'ADN est observée pour les bactéries, notamment pour des gènes de résistance aux antibiotiques. L’intégration de plasmide bactérien au génome d'undomaine différent (eucaryotes ou archaea) est limité à des bactéries

à un stade de son développement. * Dans certains cas, l'insertion du transgène dans un vecteur. Ce vecteur peut comporter des séquences de régulation, réplication ou encore des marqueurs de sélection. Les vecteurs les plus connus sont les plasmides, petites boucles d'ADN d'origine bactérienne. Les séquences de régulation comportent obligatoirement un promoteur adapté à l'organisme receveur. Les marqueurs de sélection sont généralement des gènes de résistances à des antibiotiques ou des herbicides

représentations culturelles et spirituelles sur ce qu’est la vie et ce qu’est l’être humain. II-Technique Techniques de transfert direct : La transformation directe consiste en l'introduction dans l’ADN d'un gène véhiculé le plus souvent par un plasmide classique, par le biais de techniques physico-chimiques. Il existe plusieurs techniques de transfert direct que nous allons expliciter : l’électroporation, la micro-injection et la biolistique. 1 – L’électroporation : L'électroporation est une