Plasmide Ti

Résumé Durant ce TP, des molécules d'ADN ont été clonées, c'est-à-dire que leur quantité a été amplifiée. Ce clonage a été réalisé par transformation bactérienne à partir de plasmide Blue Script et de phage lambda digérés par des enzymes de restriction. A l'issue de cette manipulation ont été obtenus des plasmides transformés et recombinés. II/ Introduction Le but du clonage est de produire de grandes quantités d'ADN à partir d'un fragment donné. Ainsi une petite quantité d'une molécule

grande vitesse de prolifération de ces dernières pour reproduire à l'identique un très grand nombre de copies de ce fragment d'ADN. Pour cela, le fragment d'ADN est au préalable introduit dans une construction que l'on appelle vecteur ou plasmide. Ce plasmide est une molécule d'ADN circulaire qui permet à la fois d'introduire la séquence d'ADN à étudier dans le microorganisme récepteur mais aussi d'assurer le maintien de ce fragment d'ADN d'intérêt dans la cellule hôte de génération en génération

fragments d'ADN par des appariements de hases complémentaires. Les fragments d'ADN ainsi réunis peuvent être liés de façon covalente au cours d'une réaction très efficace catalysée par t'ADN ligase. Dans cet exemple, une molécule d'ADN recombinant de plasmide contenant une insertion d'ADN chromosomique est formée. Par exemple, un fragment d'ADN contenant un gène humain peut être relié au chromosome d'un virus bactérien en tube à essai. La nouvelle molécule d'ADN recombinante peut ensuite être introduite

de protoplastes (cellules végétales sans paroi) et d’ADN à des chocs électriques. Le champ électrique provoque alors la déstabilisation de la membrane, facilitant le passage de l’ADN  dans le noyau. Ces protoplastes baignent dans une solution de plasmides. Ces derniers passent donc très facilement dans la cellule qui se trouve à son tour génétiquement modifié. Cette manipulation est possible car le phénomène d’ouverture des pores est réversible. En effet si le choc électrique n’a pas été trop violent

purification et clivage de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase-Isocitrate déshydrogénase (GST-IDH), exprimée par le plasmide pGEX-IDH dans la souche transformée E. coli JM103/pGEX-IDH. (NB: pGEX est en réalité pGEX-2T). I. Détermination de la taille de l’insert IDH : * Construction du plasmide pGEX-IDH : L’insertion/ligation du fragment IDH dans le plasmide pGEX-2T a nécessité que l’insert IDH et le vecteur soient clivés par les mêmes enzymes de restriction (ou compatibles). Le vecteur

deux fourches de réplication qui migrent dans les deux sens de sorte que les deux brin soit copié aux niveau des deux fourches de réplication. C’est ce mode ci qui est utilisé par la majorité. Pour les chromosomes circulaires, ie bactéries, les plasmides et certain virus, une origine de réplication suffit et les deux fourche qui en parte se confondent au coté opposé. En ce qui concerne les longs chromosomes eucaryotes, en générale ils comportent un grand nombre d’origines de réplication. Les deux

résistance aux sulfamidés par un transfert horizontal entre les deux espèces. C-Mécanismes de transfert d’éléments génétiques : Les bactéries peuvent transférer des éléments mobiles de leur génome : plasmides et transposons. Les bactéries ont rassemblé plusieurs gènes de résistance sur leur plasmide et l’échangent. La transformation : la bactérie acquiert et incorpore de l’ADN exogène nu présent dans son environnement. Cela peut être de l’ADN d’une bactérie qui, une fois capté, permet l’expression

mammaires…) ou à un stade de son développement. • Occasionnellement, l'insertion du transgène dans un vecteur. Ce vecteur peut comporter des séquences de régulation, réplication ou encore des marqueurs de sélection. Les vecteurs les plus connus sont les plasmides, petites boucles d'ADN d'origine bactérienne. Les séquences de régulation comportent obligatoirement un promoteur adapté à l'organisme receveur. Les marqueurs de sélection sont le plus souvent des gènes de résistances à des antibiotiques ou des herbicides

TCHAMDJA Samssoundine Chargé du cours: Dr TCHACONDO Tchadjobo SOMMAIRE INTRODUCTION I. Structure du matériel génétique a) L’ADN Eucaryote b) L’ADN Bactérien II. Organisation de l’ADN Bactérien et Eucaryote 1. ADN Bactérien  Les plasmides  Le nucléoϊde 2. ADN Eucaryote  ADN nucléaire  ADN mitochondrial  ADN plastidial III. Fonctionnement des ADN bactérien et Eucaryote 1) Comparaison de la réplication et de la structure des gènes entre les bactéries et les eucaryotes

connues. La quantité d’ADN total déposé dans les puits 1 et 2 est le double de celle des puits 3 et 4. Après coloration par le bromure d’ethidium**, l’image suivante est obtenue. * On rappelle qu’un cosmide est un vecteur artificiel constitué d'un plasmide auquel a été ajouté le site COS du bactériophage lambda. L'intérêt des cosmides réside dans le fait qu'ils permettent le clonage de fragments d'ADN de grande taille soit environ de 45kpb. ** Le bromure d'éthidium (BET) une molécule aromatique