Taq polymérase

VITRO PCR La PCR ou Polymerase Chain Reaction (la réaction en chaîne par polymérase) est une technique qui permet d’amplifier l’ADN ou l’ARN in vitro. Elle a été développée par Kary Bank Mullis (prix Nobel de chimie en 1993). La PCR se base sur le principe suivant : • • • Connaître d’abord les fragments (20 nucléotides) qui encadrent la séquence d’ADN à amplifier. Synthèse de séquences complémentaires à ces fragments : ce sont les amorces oligonucléotidiques. L’ADN polymérase commence la synthèse

plasma) des organismes génétiquement modifiés et des virus des hépatites B, C et D. Elle est basée sur la combinaison de deux facteurs : Les propriétés de synthèse enzymatique et d’initiation spécifique à l’ADN double brins spécifique des ADN polymérases dépendantes à l’ADN thermostables. Les propriétés d’hybridation et des hybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température. 1.2 Les acteurs de la PCR La PCR comporte plusieurs acteurs : L’ADN : Avant la réaction de PCR

mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN. Principe : La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Pour

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Amplification des acides nucléiques PCR RT-PCR PCR en temps réel Et leurs applications La PCR : une révolution technologique en biologie moléculaire APPLICATIONS : - Médecine légale * Identification d’un suspect * Recherche de paternité - Détection de microorganismes pathogènes (à ADN ou à ARN) - Diagnostics préimplantatoire et prénatal - Etude de l’expression des gènes - Détection de mutations - Agroalimentaire (OGM) Etude d’un cycle de PCR 1

réplication Eucaryotes Procaryotes Déroulement de l’hélice d’ADN Topoisomérase type I et II Hélicase Hélicase Synthèse des amorces ARN PrimaseADN pol ALPHA Polymerase 5’-> 3’ Pas d’activité exonucléasiquePrimaseAllongement de l’ADN ADN pol DELTA Polymérase 5’ -> 3’ Exonucléasique 3’ -> 5’ ADN pol III Polymérase 5’ -> 3’ Activité exonucléase 3’ -> 5’ Destruction des amorces RNAse H ou FLAP endonucléase ADN pol EPSILON même rôle que la DELTA ADN pol BETA Répare

de la construction génétique : la PCR La technique d'amplification génique in vitro connue sous le sigle P.C.R. (Polymerase Chain Reaction) consiste en une multiplication exponentielle d'un fragment d'acide nucléique dont la taille est généralement comprise entre 200 et 3 000 paires de bases. Cette technique utilise une ADN polymérase particulière, dénommée Taq polymérase, issue d'une bactérie (Thermophilus aquaticus) vivant dans des sources d'eau chaude, près des fumeurs noirs. Cette enzyme

une partie d'entre eux. Ces oligonucléotides fixés vont servir d'amorces au fragment de Klenow de l'ADN polymérase I qui va reconstituer l'intégrité des deux fragments en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au 32P. Des ADN polymérases par exemple dérivée du phage T7 sont actuellement les plus utilisées. Marquage en 3' : * avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transcriptase reverse. * avec une exonucléase * avec une terminal transférase L'ADN peut

Nomenclature IGM Les polymérases ADN polymérase IGM Les polymérases Activité exonucléase 3' 5' Activité exonucléase 5' 3' ADN polymérase IGM Les polymérases ADN polymérase I (E. coli) Activité exonucléase 5' 3' Activité exonucléase 3' 5' Taux d'erreur X 10-6 Fragment de Klenow (E. coli) ADN polymérase T4 ADN polymérase T7 (sequenase) ADN polymérase Taq (T. aquaticus) + + + + 10 + 285 9 40 5 Les ADN polymérases les plus fréquemment

de la nouvelle chaîne dans le sens 5'-3' La synthèse de la nouvelle chaîne d'ADN est réalisée par une ADN polymérase, qui ajoute les nucléotides présents dans le milieu à l'extémité 3'OH d'un nucléotide correctement apparié. La synthèse se fait donc dans le sens 5'-3' : Il est nécessaire que la synthèse se fasse dans le sens 5'-3' : en effet, l'activité correctrice de la polymérase ne peut marcher que dans ce sens. L'activité correctrice consiste à exciser un nucléotide mal apparié qui vient

vérification de l’efficacité de l’extraction. 3 . Principe de la PCR But de la PCR : obtenir par réplication des copies multiples d’un fragment d’ADN sélectionnée d’un extrait. Nôtre mélange réactionnel contient des amorces, des ADN polymérases (Taq polymérase), l’extrait d’ADN contenant les brins à amplifiés, des dNTP en excès (bases nécessaire à la formation des nouveaux brins). 1° Dénaturation de l’ADN : Par chauffage, les liaisons hydrogènes localisées entre les deux brins d’ADN ne vont