Thermus aquaticus

Pour cela il faut un fragment d’ADN de base (celui que l’on veut dupliquer), des nucléotides (dNTPs), des amorces choisies pour amplifier que la partie qui nous intéresse, une ADN polymérase (ici la Taq polymérase isolé de la bactérie thermophilus aquaticus résistante à de hautes températures) et des cofacteur de l’ADN polymérase (MgCl2…). Le mécanisme est le suivant : 5’ 3’ ATG STOP 3’ 5’ Dénaturation 30 sec à 94°C Amorce 1 Amorce 2 Hybridation des amorces 30sec à 58°C X30 Synthèse

l'eau froide, par exemple) et un vaste champ d'études biologiques. Les protéines et enzymes extrêmes constituent un marché en plein essor (biotechnologie et industrie chimique). L'exemple le plus spectaculaire est la Taq polymérase provenant de Thermus aquaticus qui est largement employé pour les réactions de PCR. * L'apparition de la vie a peut-être eu lieu dans un environnement extrême. L'atmosphère primitive de l'époque, sans oxygène et sans ozone, laissait passer les UV du soleil qui pouvait

- Pas en trop fort quantité : 10 ng dans 50 (inhibition de l’amplification ou smear) l - Pas trop de séquences GC (difficile à dénaturer) - Dans des parties spécifiques du gène Les enzymes - Taq ADN polymérases : les plus utilisées (thermus aquaticus : Eubactérie) - Polymérases d’archaebactéries (pfu, pfx) - Chaque enzyme a ses propriétés intrinsèques (processivité, fidélité, [MgCl2] → Mise au point si on change d’enzyme - Fonctionnent jusqu’à 100°C mais cette température endommage l’ADN

supérieure à sa Tm (en pratique, environ 95°C) pour séparer les deux brins. Les éléments nécessaires à cette réplication sont présents dans le tube, à savoir : 1. l’enzyme Taq polymérase : c’est une polymérase thermostable, extraite d’une bactérie (Thermus aquaticus) des sources chaudes (80-90°C). D’autres enzymes thermorésistantes sont actuellement utilisées t proviennet d’autres microorganismes : la pfu extraite de Pyrococcus furiosus et Vent extraite de Thermococcus liforalis. 2. les nucléotides triphosphates

l’échantillon ou des réactifs utilisés dans les protocoles d’extraction d’ADN. L’ADN polymérase : Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles. Le tampon : Le

GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' Cohésives HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' Cohésives MstII Microcoleus species 5'CCTNAGG 3'GGAMTCC 5'---CC TNAGG---3' 3'---GGAMT CC---5' Cohésives TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' Cohésives NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'--GC GGCCGC--3' 3'--CGCCGG CG--5' Cohésives HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC 3'CTNAG AluI Arthrobacter luteus 5'AGCT

particuliers Acetobacter Glu en Vit C Saccharomyces cerevisiae levure du boulanger Xanthomonas Produit visqueux (Xanthan) --> stabilisateur Lactobacillus lactose en ac.lactique Saccharomyces Aspargillus lactase S. cerevisiae Thermus aquaticus sucre en Co2 et Et-OH Enzyme thermostable pour PCR Xanthomonas Bactéries dégradent les huiles- graisses en Co2 et produits non toxiques Bactéries utilisent le méthane pour dépollution de champs ou déchets produisent une enzyme

les erreurs ADN pol I Synthèse 5’ -> 3’ Activité exonucléase 5’ -> 3’ Peut don détruire les amorces Ligation (ATP dépendant) ADN ligase Rattache le 5’phosphate au 3’ OH ADN ligase Les ADN polymérases extraites de bactéries THERMUS AQUATICUS PYROCOCUS FURIOSUS Nom de l’ADN polymérase Taq polymérase Pfu polymérase Température d’activité 70°-75°C 8 fois plus efficace à 100°C Activité polymérase 5’ => 3’ 5’ => 3’ Activité exonucléase Aucune 3’ => 5’ capable de correction

et répété environ 30 fois). Mise au point par Kary Mullis en 1985 (prix Nobel de chimie), elle est maintenant automatisée et utilise la Taq polymérase (une ADN polymérase ré- sistante a de hautes températures, purifiée a partir de la bactérie Thermus aquaticus). La séquence d’ADN a amplifier est délimitée grace a des amorces de nucléotides complé- mentaires des extrémités de la portion du génome a amplifier. Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : 1. La dénaturation del’ADN (par chauffage

de réparation. Les polymérases réplicatives de cette famille comprennent notamment la polymérase du bactériophage T7 et l’ADN polymérase eucaryote γ. Parmi les ADN polymérases de réparation, on peut trouver l’ADN Polymérase I de E. coli, de Thermus aquaticus et de Bacillus stearothermophilus. Ces polymérases de réparation sont impliquées dans des processus de réparation par excision et dans la synthèse des fragments d’Okazaki du brin retardé lors de la réplication. [modifier] Famille BCette famille