Tp Purification Thrombine

Structure et fonctions des protéines 1 Purification de la thrombine I . Résumé La prothrombine est le précurseur de la thrombine, protéinase qui initie la dernière étape de la cascade de coagulation du sang par dégradation du fibrinogène en fibrine. Le but de ce tp est de tester la stabilité de la thrombine. Pour cela nous allons réaliser 2 étapes de purification de la prothrombine issue du plasma de sang de cheval. La première étape consiste à séparer la prothrombine du plasma. Cette

Compte rendu du TP de Structure et Fonction des Protéines (BIO71). Purification et Stabilité de la Thrombine. Résumé: Ce TP a pour but de purifier et de tester la stabilité de la thrombine, enzyme de la coagulation sanguine. La purification de la prothrombine comporte normalement 3 étapes: précipitation au chlorure de baryum, dialyse et chromatographie échangeuse d'ions. Au cours de ce TP, nous avons pu réalisé que 2 de ces étapes: la précipitation et la chromatographie car l'étape de

RESUME Le TP se déroule en grandes parties, la première est la purification de la prothrombine à l’aide de la précipitation au BaCl2 te de la chromatographie échangeuse d’ions , la deuxième partie à pour but de tester la stabilité de la thrombine par dénaturation à l’urée et fluorométrie. Dans cette première partie, nous avons mis en évidence la forte présence de thrombine dans le plasma, puis après précipitation et centrifugation nous avons constaté la présence de thrombine dans les culots et

TP : Purification de la Thrombine Résumé : La thrombine est une enzyme protéolytique impliquée dans la coagulation du sang et l’agrégation des plaquettes. Elle est synthétisée dans le foie et sécrétée sous forme de prothrombine qui va être clivée en thrombine. Le but de ce TP est d’isoler cette prothrombine et pour cela 3 étapes sont nécessaires : précipitation au BaCl₂, dialyse et chromatographie échangeuse d’ions. La dialyse pouvant durer plusieurs jours, seules les 2 autres étapes vont

ensuite clivée en thrombine, ou facteur IIactivé (IIa), par le facteur Stuart activé ( Xa ) . La thrombine est une glycoprotéine de la famille des sérine-protéases . Cette enzyme protéolytique bicaténaire est l'élément central du système de coagulation du sang. La thrombine va alors permettre de transformer le fibrinogène en fibrine, d'activer les plaquettes par les récepteurs PAR et donc de permettre au sang de se coaguler. Cette transformation de la prothrombine en thrombine peut aussi se faire

PREAMBULE : La prothrombine (ou le Facteur II) est une chaîne polypeptidique précurseur de la thrombine (ou le Facteur IIa), protéinase qui initie la dernière étape de la cascade de coagulation du sang par dégradation du fibrinogène en fibrine (voir figure 2). Le TP propose de réaliser 2 des 3 principales étapes de purification de la prothrombine issue du plasma de sang de cheval. Un test enzymatique coloré (chromogénique) vous permettra de suivre spécifiquement cette activité. Sang citraté (non

but de ce TP est d’obtenir l’isocitrate déshydrogénase (IDH) par voie recombinante. On utilise comme système d’expression E.coli (souche JM109) transformé par le plasmide pGEX-2T dans lequel on a inséré le gène de l’IDH. L’IDH recombinante exprimée est en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à des fins de purification par chromatographie d’affinité sur une colonne glutathione sepharose 4B. L’IDH peut être étudiée et dosée après clivage de la protéine de fusion par la thrombine. II-

initier la production de chémokines. C'est le cas de l'hypoxie, de l'ischémie-reperfusion, de la coagulation et des radiations ; il en est de même pour de nombreux médiateurs directement impliqués dans l'inflammation comme le monoxyde d'azote, la thrombine, la tryptase, l'élastase, l'anaphylatoxine C5a, les leucotriènes B4 ou l'histamine, générant ainsi une boucle d'entretien du processus inflammatoire. Il existe près d’une cinquantaine de cytokines de faible poids moléculaire (8-12 kDa) présentant

d’affinité Principe : On fixe L ou P sur une matrice immobilisée sur colonne en général (Silice, Polystyrène, Sepharose,...) Cette transformation est supposée respecter l’affinité. On se crée de la sorte une colonne d’affinité selon le problème (purification) à résoudre Par exemple, fixation covalente de L sur bras espaceur luimême rattaché à matrice Etapes théoriques : On charge la colonne en mélange de protéines On chasse les protéines non ou moins affines par élution (via solutions tampons) On