Transfection

Taille max approximativement du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur Type de vecteur Taille ADN cloné en Kb Plasmide 20 Phage ʎ 25 Cosmide 45 Phage P1 100 BAC 300 YAC 1000 1.5.2 Intérêt Introduction d’un gène dans les cellules =transfection ou dans des organismes= transgénèse. Etude des mécanismes de l’expression d’une séquence d’ADN ou de production d’ARN. A l’échelle industriellle, la production de protéines codées par des gènes (insuline, vaccins, médicaments, hormones …) Ex de

, 1992) and cloning of the XPAC gene has been achieved by direct complementation of XP-A cells using a genomic D N A transfection procedure (Tanaka et al., 1989). Genes that correct defective DNA repair in XP-B (Weeda et al., 1990a,b), XP-D (Weber et al., 1988, 1990; Flejter et al., 1992), and CS-B (Troelstra et al., 1990, 1992) cells have been cloned through genomic transfection of UV-sensitive mutants derived from Chinese hamster ovary (CHO) cell lines. A functional selection procedure has been

reconstitution en 3D à partir de la figure B. La figure C représente des cellules transfectées avec de la GFP seule. Question 11 : En vous basant sur les documents ci-dessus et vos connaissances, indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) : A. La transfection est une méthode d’introduction de molécules dans une cellule qui nécessite l’utilisation d’une micropipette B. La GFP correspond à la Green Fluorescent Protein C. Ce résultat est en contradiction avec le résultat du QCM 1 D. Les cellules MA104

• Des mutants B. • Des mutants AB. On apporte du nouvel ADN dans la cellule = transfection (chez les eucaryote = transformation chez les procaryote). Transformation chez les eucaryotes, c’est quand la ¢ va vers un stade cancéreux. La transfection peut être définitive (intégration de l’ADN dans le noyau), ou transitoire (on se contente de la présence de l’ADN dans le noyau). Ici, on se contente d’une transfection transitoire. Aa- immunoprécipitation fait avec des Ac anti PCNA. Ab- extrait

indirect qui fonctionne par l’intermédiaire de bactéries qui transporte le gène d’intérêt. Dans cette deuxième partie nous allons voir comment ces méthodes sont mises en action. ➢ Technique de transfert indirect • La transfection biologique : C’est une méthode plus naturelle que vue précédemment, elle utilise les propriétés des bactéries. Pour l’expliquer nous allons diviser cette technique en cinq grandes étapes : 1. Il faut tout d’abord introduire le gène dans un

culture, on fait rentrer par transfection l’ADN à l’intérieur des cellules et on dose la quantité d’ADN : on fait rentrer un plasmide. Plus l’activité CAT est élevée, plus le promoteur est actif. Si transfection dans cellules de muscle, il y a un promoteur de myosine qui entraîne une augmentation de l’activité CAT. On fait donc une étude en fonction du type cellulaire ou du milieu extérieur. A partir de cellules, on fait donc rentrer l’ADN (24h après la transfection) On lyse les cellules On dose

digestion ; transformation de la souche BL21 d’E. coli à l’aide d’un plasmide recombiné avec l’ADNc de la métalloprotéinase 2. trois demi-journées de Biologie cellulaire et Immunologie : mise en évidence de l’expression des protéines par test ELISA; transfection transitoire dans les cellules COS de six plasmides codant soit pour des protéines couplées à des protéines fluorescentes (localisation membrane plasmique, cytoplasme ou mitochondries) ou des enzymes secrétés (activité gélatinase). cinq demi-journées

293 sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) contenant 5% de sérum fœtal de veau et 1% d’un mélange pénicilline/streptomycine (Invitrogen, Merelbeke, Belgium). Les cellules sont placées 48 à 72 heures avant la transfection dans des boîtes de pétri de 35mm de marque Falcon. 20 Les cellules ont été transfectés par des plasmides contenant de l’ADNc codant pour des canaux SK à l’aide d’une solution de polyéthylèneimine (50 µl/boîte à une concentration de 0,2 µg/µl)

RESUME Les plasmides sont utilisés en génie génétique comme vecteurs de gènes. Ce vecteur fonctionne comme véhicule propageant le gène dans la cellule hôte, généralement une bactérie mais d'autres cellules peuvent aussi être utilisées après transfection ou transformation. Au départ, le plasmide va subir l’extraction et la purification ; ainsi, le plasmide va être introduit dans une bactérie suivant qu’il possède un gène d’intérêt ou après avoir subi l’insertion de ce gène. La bactérie (E. coli)

intégrine ont également une dynamique particulière d’expression lors du passage à l’étape de différenciation (Tavella et al, 1997). Ceci est d’autant plus intéressant que l’on observe une forte augmentation de l’expression de N-Cadhérine suite à la transfection de la lignée chondroblastique CFK2 par Sox9 (Panda et al, 2001). D.4. LA DIFFERENCIATION sensu stricto D’un point de vue morphologique, une fois la condensation mise en place, la différenciation cartilagineuse est donc amorcée en son centre