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Sa fondation remonte à l’époque de François Ier, lorsqu’en 1530 son « maître de librairie », le grand traducteur d’œuvres antiques Guillaume Budé, lui suggère d’instituer un collège de « lecteurs royaux ». Des humanistes payés par le Roi sont chargés d’enseigner des disciplines que l'Université de Paris ignorait. Deux postes de professeurs furent initialement créés, un pour le grec et un pour l’hébreu, puis ce nombre passa rapidement à dix avec l'enseignement du droit français, du latin, des mathématiques et de la médecine. Dès lors le Collège royal, dont la devise est « Docet omnia » (Il enseigne tout), restera un des lieux d’excellence de la transmission du savoir en France.
Ce fut sous le règne d'Henri II qu'il occupa son emplacement actuel, d'abord abrité dans les Collèges de Tréguier et de Cambrai. Leur réunion fut décidée par Henri IV et le projet d'un unique édifice arrêté pour les remplacer. Claude Chastillon devait en dessiner l'aspect. L'assassinat du roi limita l'exécution du projet et seule une partie du collège prévu fut réalisée sous la régence de Marie de Médicis (1612).
Ce ne fut qu'en 1772 que des travaux, menés par l'architecte Jean-François Chalgrin, apportèrent des agrandissements autour de la cour d'honneur. Les dernières modifications datent du milieu du XIXe siècle. Elles furent dirigées par l'architecte Paul Letarouilly qui donna son aspect actuel au Collège de France.
D'abord appelé « Collège royal »,