But de la manipulation

Le but de ce TP est avant tout de mettre en évidence la présence d'anticorps spécifique anti-BSA dans le sérum d'un lapin immunisé par le BSA et de titrer la réactivité anticorps par une technique immuno-enzymatique l'ELISA cela va permettre de quantifier les anticorps anti-BSA.
Ce TP a aussi pour but de nous familiariser avec le matériel utilisé pour l'ELISA et de nous exercer à faire des dilutions.

Principe de l'ELISA

Tout d'abord on sensibilise les puits en déposant dans chacun une solution de BSA, on couvre la plaque et on la laisse à 4°C toute une nuit.
Ensuite on fixe l'antigène, ici le BSA, sur les parois des puits de la plaque en polystyrène traitée. La fixation s'effectue à pH alcalin (9,3-9,6) cela favorise l'adsorbtion de l'antigène. L'excès d'antigène non adsorbé est éliminé par lavages successifs.

On ajoute ensuite dans les puits le sérum à tester à différentes concentrations, on fait également des puits de contrôle car l'ELISA est une technique très sensible où peuvent apparaître des faux négatifs et faux positifs. On laisse incuber. Après incubation les puits sont de nouveau lavés pour éliminer les anticorps non fixés.

Ensuite on ajoute un anticorps secondaire anti-immunoglobuline couplé à une enzyme. Ce système d'anticorps secondaire va amplifier le signal. On laisse incuber et on lave les puits pour éliminer l'excès.

Enfin on dépose dans chaque puits le substrat de l'enzyme. Cela va donner un produit coloré qui absorbe à 410 nm.
Par spectrophotométrie on va lire l'absorbance dans les différents puits.

Méthodes d'expérimentation

Nous disposons d'une solution mère de BSA 10% pour la sensibilisation des puits qu'il faut diluer au 100ème avec un tampon carbonate 0,1 M pour obtenir une solution de BSA 1µg/ml. On dépose ensuite dans chaque puits (48 puits) 100 µl de cette solution.

Nous avons également une dilution au 1/100 de deux sérums de lapin, normal et anti-BSA, quatre fractions F1 à