Bien avant la Révolution française, Guillotin est célèbre pour avoir publié plusieurs ouvrages politiques et avoir proposé un certain nombre de réformes. Dans son livre Pétition des six corps (ou Pétition des citoyens domiciliés à Paris) rédigé le 8 décembre 1788, il réclame le vote par tête (et non par ordre aux états généraux) et que le nombre des députés du tiers état soit au moins égal à celui des députés des deux autres ordres. Cette proposition lui vaut au départ la réprobation du roi (plusieurs personnes avaient déjà adressé ce genre d'écrit au souverain, mais dans une correspondance personnelle et non en appelant à lui publiquement par voie de requêtes) et de passer en jugement. Le Parlement de Paris la condamne le 20 décembre 1788 pour la forme et non pour le fond, comme le fait remarquer le conseiller Lefebvre « Ce jugement concerne la forme de votre écrit et son mode de diffusion. Quant au fond, le Parlement, dont je suis ici l'interprète, n'y trouve rien à redire » : la pétition est alors interdite de diffusion. Le 27 décembre 1788, sur la demande de Necker, elle est acceptée par le Conseil d'État du roi.
Il fut médecin du comte de Provence. Initié en 1772 à la loge la Parfaite Union d’Angoulême, il devint en 1776 Vénérable de la loge La Concorde fraternelle à l’Orient de Paris et en 1778 membre affilié à celle des Neuf sœurs (cotoyant les peintres Jean-Baptiste Greuze ou Claude Joseph Vernet, Voltaire, le duc d’Orléans ou le duc de Chartres)3. Il fréquenta tout au long de sa vie ces ateliers empreints de rationalité et de liberté et joua un rôle prépondérant dans la formation du Grand Orient de France.
Élu député du Tiers-État de la ville et des faubourgs de Paris aux États-Généraux de 1789, c'est lui qui propose la réunion dans la salle du Jeu de paume, lorsque les députés trouvèrent leur salle fermée le 19 juin.

Avec l'appui de Mirabeau, député et secrétaire de l’Assemblée nationale constituante, Guillotin propose le 9 octobre 1789 un projet de