Pour faire tomber les Borgia, il faudra retourner la ville contre eux, compter sur ses habitants et redonner sa splendeur à la cité en rénovant échoppes, bâtiments et monuments, comme on le faisait à la villa dans le second volet. Quadrillant Rome, les tours des Borgia la maintiennent sous leur influence. Ces tours, il vous reviendra de les détruire après avoir assassiné les capitaines qui les gardent, défendus par une tripotée de gardes. Chaque tour détruite, c'est une partie de la ville "libérée" (mais pas vide de soldats). C'est à ce prix qu'il sera possible de dépenser son argent dans la rénovation des boutiques de forgerons ou de médecins qui vous fourniront en matériel, les banques, les édifices publics ou encore les entrées des tunnels grâce auxquels le joueur n'aura pas à marcher pendant une heure pour traverser la ville. C'est d'ailleurs une des premières choses qu'il vous faudra accomplir pour retrouver le soutien des voleurs, des mercenaires et des courtisanes, factions qui seront toujours là pour vous épauler en cours de jeu, pour vous aider au combat ou faire diversion. Mais abattre les tours Borgia vous donnera accès à une autre nouveauté de cet épisode. Ezio va quelque peu agrandir la confrérie des assassins ici, recrutant des citoyens pour en faire des alliés. Des recrues qu'il est possible d'appeler à tout moment pour leur demander d'abattre une cible ou même, lorsque la possibilité est débloquée, de lancer une pluie de flèches sur une bande de gardes et de les éliminer rapidement.
Profitant d'un repos bien mérité dans sa villa de Montereggioni, Ezio Auditore croyait sa mission terminée après avoir mis la main sur la Pomme d'Eden. Mais il n'est pas de repos pour l'Assassin qui va devoir faire face aux représailles de la famille Borgia carrément venue attaquer son domaine. Une famille de grands malades despotiques confortablement installée à Rome qu'elle contrôle politiquement, économiquement et religieusement. Pour chercher vengeance et surtout