LA TECHNIQUE D’AMPLIFICATION IN VITRO PCR
La PCR ou Polymerase Chain Reaction (la réaction en chaîne par polymérase) est une technique qui permet d’amplifier l’ADN ou l’ARN in vitro. Elle a été développée par Kary Bank Mullis (prix Nobel de chimie en 1993). La PCR se base sur le principe suivant : • • • Connaître d’abord les fragments (20 nucléotides) qui encadrent la séquence d’ADN à amplifier. Synthèse de séquences complémentaires à ces fragments : ce sont les amorces oligonucléotidiques. L’ADN polymérase commence la synthèse des brins complémentaires grâce aux amorces et le nombre de copies de la séquence d’ADN est doublé pour chaque réplication.

6-1/ Réalisation de la PCR : L’ADN à amplifier est chauffé à une température supérieure à sa Tm (en pratique, environ 95°C) pour séparer les deux brins. Les éléments nécessaires à cette réplication sont présents dans le tube, à savoir : 1. l’enzyme Taq polymérase : c’est une polymérase thermostable, extraite d’une bactérie (Thermus aquaticus) des sources chaudes (80-90°C). D’autres enzymes thermorésistantes sont actuellement utilisées t proviennet d’autres microorganismes : la pfu extraite de Pyrococcus furiosus et Vent extraite de Thermococcus liforalis. 2. les nucléotides triphosphates : Au départ on utilisait des concentrations qui allaient jusqu’à 1,5 mM. Mais cette concentration cause des amplifications parasites dues aux erreurs de réplication. Les concentrations de 20 à 200 µM sont de plus en plus utilisées. 3. les amorces : ces oligonucléotides initient le travail de la Taq polymérase. Leur Tm est de 5°C de moins que la température d’hybridation. Généralement, ce sont les valeurs comprises entre 55 et 70°C qui donnent de bons résultats avec de concentrations de 0,1 à 0,2 µM. 4. les ions magnésium : A des concentrations de 0,5 à 2,5 mM, ils servent de stabilisateurs pour les nucléotides et activent l’enzyme. Etape 1 : Une fois tous les éléments rassemblés, l’ADN à amplifier est chauffé jusqu’à 90°C pendant 30