Fiche technique n°5 : Les colorations de Gram & au bleu de méthylène

La coloration de Gram

Principe :
La coloration de Gram permet de distinguer les bactéries à Gram négatif qui apparaissent roses et les bactéries à Gram positif qui apparaissent violettes. Cette différence de coloration est liée à des différences de nature de la paroi bactérienne.
Elle permet de renseigner sur : - le type Gram + ou Gram – ; - la forme des bactéries (coque, bacille) et autre détails morphologiques (extrémités arrondies…) ; - la taille ; - le mode de regroupement ; - l’homogénéité de la forme et de la couleur.

Mode opératoire : • réaliser un frottis et le fixer (voir fiche technique n°4) ; • plonger la lame dans le violet de gentiane (ou cristal violet) pendant 1 minute ; • plonger la lame dans une solution de lugol pendant 1 minute ; • rincer à l’eau distillée les deux faces de la lame ; • décolorer dix secondes à l’alcool (face vierge d’abord puis frottis) ; • rincer immédiatement à l’eau distillée ; • plonger la lame dans la safranine (ou la fuchsine) phéniquée pendant 1 minute ; • laver la lame à l’eau distillée ; • sécher la lame en la tamponnant avec du papier Joseph ; • observer à l’objectif x100 à l’immersion (voit fiche technique n°1)

La coloration au bleu de Méthylène

Principe :
La coloration au bleu de méthylène (BM) est une coloration très simple qui permet d’observer les bactéries, les champignons, mais aussi les cellules qui sont en général mieux conservées qu’avec la coloration de Gram. Elle permet de renseigner sur : - la forme des bactéries et autres détails morphologiques ; - la taille ; - le mode de regroupement.

Mode opératoire : • réaliser un frottis et le fixer ; • recouvrir la lame de bleu de méthylène phéniqué, 1 à 2 minutes ; • rincer à l’eau distillée ; • sécher la lame entre 2 feuilles de papier