Activation/Inhibition de la voie des MAP Kinases
Introduction
Le but de ce TP est d’étudier la voie des MAP Kinases à partir de cellules NIH3T3, synchronisées en phase G0, issues d’une lignée de fibroblastes embryonnaires de souris.
La voie des MAP kinase est une cascade de phosphorylation par des kinases. Lors de ce TP nous allons étudier les kinases Erk 1/2 et ainsi mettre en évidence la phosphorylation ou non de ces kinases Erk dans différentes conditions de culture cellulaire. Deux techniques sont utilisées pour étudier la voies de MAP kinase : le Western Blot (une technique quantitative) pour montrer la présence ou non de Erk phosphorylé ou déphosphorylé et l’immunocytochimie (technique qualitative) pour mettre en évidence de Erk phosphorylé ou non dans la cellule.
Matériel et méthodes
1) Western Blot
a) Traitement des cellules
Les cellules NIH3T3 ont été cultivées 24h en présence de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sans sérum pour les synchroniser en phase G0. Le DMEM est un milieu défini comme contenant des vitamines, du glucose et des acides aminés essentiels. Les cellules sont ensuite lavées puis pré-incubées pendant 30 minutes et activées pendant 15 minutes comme suit.

Ø Ø Ø Ø U0126 SVF10%

Ø SVF10% DMSO U0126 SVF10% U0126

Les cellules sont rincées puis lysées pour récupérer le contenu cellulaire. Le tampon de lyse contient du Béta-Mercaptoethanol qui est un dénaturant, des inhibiteurs de protéases afin d’éviter la dégradation des protéines et des inhibiteurs de phosphatases puisque nous voulons étudier la présence de Erk phosphorylé.
Le lysat est ensuite bouilli pour arrêter la réaction et débarrasser les extraits de phosphatases et protéases et les tubes sont conservés sur de la glace.
b) Préparation du gel et migration Le gel de polyacrylamide est coulé en faisant polymériser un gel de séparation puis un gel de concentration (avec un peigne pour les puits) comme suit :