TP – Séparation de l’albumine du sérum par chromatographie d’affinité

I) But
Le but de ce TP est l’extraction de l’albumine du sérum humain.
II) Principe
On effectue pour cela une chromatographie d’affinité. Le sérum est déposé dans une colonne à chromatographie contenant une résine de Bleu Sépharose CL-6B, spécifique à l’albumine, et est élué à l’aide de 2 tampons différents. Lors du lavage, où l’on utilise le tampon A, les protéines non spécifiques ne sont pas retenues dans la résine et sont éliminées, tandis que l’albumine est adsorbée spécifiquement sur le ligand, ici la résine de Bleu Sépharose. Pour l’élution, on utilise le tampon B qui est de l’acide chlorhydrique. Ce composé a une grande force ionique, et va saturer le milieu : c’est le phénomène de salting out, et permet d’éluer l’albumine fixée sur la résine. Le collecteur est programmé pour distribuer 1,5mL dans chaque tube, de manière à avoir le même volume dans les tubes contenant l’éluat que dans la gamme étalon contenant la solution mère d’albumine bovine, pour que les résultats soient interprétables.
Afin de déterminer la concentration d’albumine dans le sérum, on réalise une gamme étalon ainsi qu’un profil d’élution. On utilise une solution mère d’albumine bovine (SMA) dont la concentration est connue, et on en introduit différents volumes dans des tubes à essai, de manière à avoir plusieurs concentrations de cette solution. On réalise également deux tubes témoins pour les tampons B et A, qui correspondent respectivement aux tubes 8 et 9. Le tube 1, qui ne contient que de l’eau distillée et du biuret, est un témoin négatif.
De cette manière, en effectuant un dosage spectrophotométrique de cette gamme étalon ainsi que des échantillons récupérés par le collecteur, on peut calculer la concentration en albumine dans la solution de départ par des méthodes graphiques, car l’absorbance est proportionnelle à la concentration, comme on peut le voir dans la relation : A= ε × l ×c, avec A=