EXTRACTION DE L'ALBUMINE PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE

BUT
Le but de ce tp est de séparer une protéine précise, l’albumine d’un mélange de protéines par chromatographie d’affinité.

PRINCIPES

Purification de l'abumine par chromatographie d'adsorption :

Les chromatographies d'adsorption sont des méthodes de séparation où la molécule d'intérêt d'un mélange complexe (albumine dans notre cas) est isolée des autres constituants parce qu'elle se lie spécifiquement à la résine ou matrice sur laquelle on fait la chromatographie. La nature de cette liaison est variable. Si c'est une interaction ionique, il s'agit d'une chromatographie d'échange ionique. Il peut aussi s'agir d'une chromatographie d'affinité (CA) où la séparation se fait parce que la molécule d'intérêt a une affinité d'ordre biologique ou fonctionnelle pour une composante de l'adsorbant et est donc capable de s'y lier de façon stable.
Dans notre cas il s'agit d'une chromatographie d'affinité de type ligand récepteur.
La chromatographie d'affinité se fait avec une résine (Sepharose CL-6B) sur laquelle est immobilisée par covalence une molécule (Bleu Cibacron F3 G-A) ayant la propriété de se lier non covalentiellement et spécifiquement à celle qu'on veut isoler (Albumine). L'adsorption consiste à mettre en présence un mélange contenant la molécule d'intérêt et la résine contenant le ligand dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique. Les molécules n'ayant pas d'affinité pour le ligand ne se fixeront pas sur la résine et pourront être éluées (avec le tampon A) , tandis que celles ayant une affinité y resteront attachées. Ensuite, quand toutes les molécules sans affinité auront été complètement éliminées, on pourra procéder à la désorption des molécules restées attachées au ligand. Ceci se fait en exposant le complexe résine-molécules spécifiques à des conditions où l'interaction ligand-molécule spécifique est moins stable. Généralement on modifie la