TP Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative

I. But :
Ce TP a pour but d’extraire l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’un culot d’E.coli, d’établir la carte de restriction du plasmide grâce à sa digestion par des enzymes et enfin d’isoler et purifier le fragment d’intérêt wzc dans pUC18-wzc.

II. Principes :
Pour mener à bien ce TP on utilise la technique d’électrophorèse sur gel d’agarose. Cette technique permettra la séparation des différents fragments obtenus par digestion, en fonction de leurs charges (application d’un champ électrique) mais surtout en fonction de leurs tailles (agarose).Le gène wzc est ainsi purifié.

III. Résultats et Interprétations :

A. Extraction du plasmide :
Pour extraire les plasmides des bactéries on utilise 3 solutions : - Solution I, permet l’hydrolyse des muropeptides de la membrane bactérienne (lysozyme) et d’être dans des conditions de milieu iso-osmotique. On ajoute dans le tampon Tris-HCl de l’EDTA qui inhibe l’action des DNases.
-Solution II ,NaOH permet de détruire les ponts disulfures et lui confère une forme linéaire, SDS permet de dénaturer ADN et dégrade ARN.
-Solution III, permet le retour à des conditions acides favorisant la réhybridation du plasmide plutôt que de l’ADN chromosomique.
Enfin on réalise une électrophorèse en gel d’agarose pour analyser notre ADN plasmidique.
Un plasmide existe sous trois formes théoriques, circulaire, linéaire et super enroulée. (Voir Figure 1)

Sur la piste 2 on observe 2 bandes, on ne considère pas la bande la plus haute car elle est assimilée à de l’ADN contaminant.
Dans la piste 2 on observe donc la migration du plasmide seul. On obtient une bande qui migre moins que la bande de la piste 3 où le plasmide est sous forme linéaire. La forme de plasmide qui migre donc dans la piste 2 serait donc la forme circulaire relâchée. Dans la forme linéaire les 2 brins d’ADN sont coupés, dans la forme circulaire dite relâchée un seul brin d’ADN