Au cours de cette séance, Votre professeur appréciera les qualités d'organisation, la précision des gestes techniques, le respect des règles d'hygiène et de sécurité en laboratoire et l’utilisation du cahier du laboratoire.

1. Introduction

1.1 La réaction catalysée

La  fructosidase ou invertase ou saccharase de levure (D fructofurannoside fructohydrolase, EC 3.2.1.26) catalyse l'hydrolyse de la liaison osidique du saccharose.

Equation :
Saccharose + eau à D-glucose + D-fructose.

= Sucre inverti

A savoir : Le glucose et le fructose sont des glucides réducteurs, mais quand ils sont liés comme c’est le cas dans le saccharose ils perdent leur pourvoir réducteur (la fonction réductrice étant impliquée dans la liaison osidique). Le mélange équimolaire de glucose et fructose issu de l’hydrolyse du saccharose correspond à du sucre inverti car il y a aussi inversion du pouvoir rotatoire.

L’avancement de la réaction n’est pas suivi en continu. Après arrêt de la réaction, le sucre inverti formé sera dosé par la méthode colorimétriques au 3.5 acide dinitrosalicylique (3.5DNS). L’alcalinité du réactif 3.5DNS et chauffage dénaturent l’enzyme et arrêtent la réaction. 1.2 Les caractéristiques de l’enzyme

Elle est localisée dans la paroi de la levure (  fructosidase externe ou exocellulaire) et dans la vacuole ( fructosidase interne ou endocellulaire ) . La  fructosidase interne ne représente qu’un faible pourcentage de l’invertase totale. La  fructosidase a un KM de l’ordre de 25 mmol/L, une masse molaire d’environ 270 KDa ( 50 % de protéines et 50 % de mannane). Son pH optimum est compris entre 3.5 et 5.5. Son site de fixation comprend un groupement COO- nécessaire à la liaison du substrat. Son site catalytique contient un noyau imidazole nécessaire à la rupture de la liaison.

1.3 Le but de la manipulation
Le but est : d’extraire et de purifier l’enzyme à partir de la levure. de déterminer la