Absorbance

conjugués. * Loi de Beer-Lambert L’absorbance d’une solution d’un composé est proportionnel à la concentration du composé en solution. * Valable à faible concentration Absorbance étalon = absorbance inconnu Concentration étalon concentration inconnu * Spectre d’absorption * Absorbance en fonction de la longueur d’onde * Utilisé pour confirmer la présence d’un composé soupçonné. * Analyse qualitative * Analyse quantitative

solvant est souvent lui-même absorbant. Pour connaître l’absorbance d’un soluté, il faut compenser l’absorbance du solvant en réglant le « zéro » de l’appareil. Par la suite, on notera absorbance ou densité optique d’une espèce, la valeur de l’absorbance due uniquement à la contribution de cette espèce (absorbance totale diminuée de l’absorbance du solvant). 1.3) Utilisation du spectrophotomètre L’appareil comprend : • Une source lumineuse (lampe à iode) • Un dispositif optique (prisme

2 g d'iodure de potassium puis compléter à 100 ml avec de l'eau distillée Dosage de l'échantillon suivant la méthode de Beer-Lambert : · La loi de Beer-Lambert obéit à la relation suivante DO = E . l . C DO ou densité optique correspond à une absorbance E (Epsilon) correspond au coefficient d'extinction molaire, (il est constant pour un produit donné) l est l'épaisseur du milieu traversé, (ici, il s'agit d'une cuve carré de 1 cm de coté) C correspond à la concentration du produit à étudier

l'absorbance A d'un mélange de n espèces absorbantes est la somme des absorbances individuelles : Exemple d'application Soit une solution contenant un mélange de Ni(II) et de Co(II), on cherche à déterminer leurs concentrations respectives CNi et CCo en appliquant la loi de Beer-Lambert. Pour cela, on mesure l'absorbance de la solution à deux longueurs d'onde différentes λa = 393 nm et λb = 510 nm qui correspondent respectivement aux absorbances maximales des deux entités en solution prises chacune à part

vitesse initiale. De plus, ce temps est assez long pour que nos valeurs d’absorbances soient exploitables. Nous avons pu exploiter nos résultats de spectrophotométrie grâce à nos deux gammes étalons et à la loi de Beer-Lambert : avec : A = absorbance = coefficient d’extinction molaire (L.mol-1.cm-1) l = longueur de la cuve (1 cm) C = concentration de la solution (mol.L-1) Résultats Etude cinétique de la libération des produits de la réaction : Gamme étalon : Pour la réaliser

lapin anti-BSA sont déposées et enfin dans les deux dernières colonnes sont déposées les dilutions doublées des fractions de purification. Résultats/Discussion Tableau des dilutions Table des valeurs de densité optique On observe une absorbance élevée pour les colonnes 3 et 4 qui correspondent au sérum de lapin anti-BSA, l'absorbance diminue quand la dilution augmente. L'absorbance est élevée ce qui signifie que l'on a l'apparition du produit de l'enzyme et du substrat. Cela signifie que

une grandeur appelée ABSORBANCE, notée A. C’est cette grandeur qui est mesurée par le SPECTROPHOTOMETRE. A n’a pas d’unité A varie en théorie entre O (solution transparente) et l’infini (solution opaque), mais les appareils sont souvent limités à quelques unités d’absorbance. Pour des solutions colorées peu concentrées (C < 10-2 mol.L-1), l’absorbance A est proportionnelle à la concentration C selon la loi de Beer Lambert : • • A = ε .l .C A C • A= absorbance, sans unité l= épaisseur

dans 2 g d'iodure de potassium puis compléter à 100 ml avec de l'eau distillée Dosage de l'échantillon suivant la méthode de Beer-Lambert : La loi de Beer-Lambert obéit à la relation suivante DO = E . l . C DO ou densité optique correspond à une absorbance E (Epsilon) correspond au coefficient d'extinction molaire, (il est constant pour un produit donné) l est l'épaisseur du milieu traversé, (ici, il s'agit d'une cuve carré de 1 cm de coté) C correspond à la concentration  du produit à étudier

de mucus intestinal de veau. I.Étude cinétique Lors du dosage on utilisera comme substrat le p-nitrophényl phosphate (PNPP) qui est hydrolysé par la phosphatase alcaline en p-nitrophénol (PNP) qui est jaune en milieu alcalin: le PNP a une absorbance maximum à 410 nm. O2N- -O-PO32- + H2O → O2N- -OH + HPO42- La densité optique (D.O) de la solution à 410 nm est donc proportionnel à la quantité de PNP présents, donc proportionnelle à la consommation de PNPP. On

unités sont à configurer en fonction du matériel utilisé. Par exemple, si le colorimètre est branché sur l’entrée ligne de l’interface ExAO, il délivre une tension comprise entre 1 et +1V. Les unités devront être modifiées pour être exprimées en Absorbance. © BORDAS 2012 • SVT T erm S Spécialité ◾◾Manipulation Remarque : la vitesse de la catalyse enzymatique est maximale au tout début de la manipulation. On doit donc commencer la mesure dès que le mélange entre la solution d’enzyme et de substrat