Cytométrie en flux

Cytométrie en flux : Fluorochromes : ce sont des composés qui lorsqu’ils sont excité par une lumière retournent a l’état de repos en émettant une lumiere de plus faible energie que celle qui la absorbé. Caractérisé par deux spectres : d’excitation(longueur d’onde d’absorption) et d’émission( longueur d’onde d’émission ). Fluorochrome et molécule étudié de doivent pas interagir, pzs de fixation non spécifique sur les cellules, le spectre d’émisssion doit etre dans le visible, la fluorescence doit

La cytométrie en flux CMF ; Définitions    Mesure ( -métrie) des propriétés optiques de cellules ( cyto) transportées par un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source d’excitation lumineuse. Mesurer simultanément plusieurs paramètres sur plusieurs milliers de cellules par seconde Combinaison de système fluidique, optique, informatique et électronique  moyen utilisé : fluorescence  quantifier et analyser des particules en suspension  Rapidité, spécificité

IMMUNOCHROMATOGRAPHIE III / IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEUR A – IMMUNOENZYMOLOGIE - ELISA (DIRECT /INDIRECT/COMPETITIF/SANDWICH) - TECHNIQUES DERIVES / WESTERNBLOT B – IMMUNOFLUORESCENCE - MARQUAGE : DIRECT /INDIRECT / SANDWITCH) - TECHNIQUES DERIVES (CYTOMETRIE EN FLUX) C - RADIOIMMUNOLOGIE A CONSULTER : HTTP://ISPB.UNIV-LYON1.FR/ETUDIANT/COURS_3A/TP3.PDF HTTP://WWW.USS-LAOS.ORG/UMVF/CAMPUS-IMMUNOLOGIE/WWW.ASSIM.REFER.ORG/TECHNIQ.PDF I / TECHNIQUE DE PRODUCTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX DÉROULEMENT DE

lymphocytaires: centrifugation simple ou en gradient de densité, les techniques de rosettes, l'adhérence spécifique et non spécifique, les séparations magnétiques, etc. Cependant les technologies utilisant des anticorps monoclonaux et les principes de la cytométrie de flux intégrés dans un trieur de cellules (L'analyseur-trieur de cellules ou Fluorescence-activated cell sorter: FACS), permettent aujourd'hui d'obtenir des populations de cellules quasiment pures. I- LA TECHNIQUE DES GRADIENTS DE FICOLL La séparation

F cus Immunophénotypage : L’immunophénotypage par cytométrie en flux (CMF) permet d’étudier à haut débit, par immunofluorescence, toute préparation cellulaire en suspension et en premier lieu le sang. Les antigènes exprimés par une cellule (« CD » : Cluster of Differentiation) permettent de la caractériser à l’aide d’anticorps couplés à des fluorochromes. Certaines structures cellulaires peuvent également être mises en évidence directement, sans anticorps. 43 technique et applications en

n’est pas spécifique à l’antigène, mais plutôt à une immunoglobuline anti-antigène. (Audigié, Claude et al., 1992 P. 119) La cytofluorométrie permet de caractériser des cellules qui ont été marquées. L’analyse peut alors se faire au cytomètre en flux puisque celui-ci est pourvu d’un logiciel qui permet d’analyser les caractéristiques de chacune des cellules lors de leur passage à travers le faisceau laser. En cytofluorométrie, la taille, la structure granulaire du cytoplasme ainsi que la fluorescence

que ceci est dû à une mauvaise manipulation. La suspension cellulaire de la rate dans le tube 8, en présence de nos deux anticorps révèle un marquage orangé. Par conséquent, il y a de nombreux lymphocyte T dans la rate. c. Cytométrie en flux Interprétations biparamétriques : Interprétations en histogramme : d. Critiques - Sur nos tubes 2,4 et 6, nous avons effectué une centrifugation supplémentaire

Utilisation des cellules: - A549 - NIH-3T3 -CEMx174 -THP-1 - HEK-293 - PolyT2-L - Clones 3, 4, 7 et 9 Figure 5: Cellules utilisées sur lames de cytospin®. Immunomarquage sur cellules "cytospinées" J'ai également effectué des marquages par immunofluorescence sur la protéine d'intérêt et sur la protéine eGFP, afin de vérifier l’expression de l’eGFP à la membrane des cellules transfectées. Pour cela, on a effectué les tests sur des cellules qui, au préalable, ont subit une centrifugation

et ARNsi  Plasmide: pEGFP/MDR1 contenant fragments du gène MDR1 fusionnés au gène EGFP 2h post transfection : mesure de fluorescence de EGFP dans les cellules par cytométrie de flux  Cellules HEK 293 +trypsine: Fixées dans 2% de formaldehyde dans un tampon de sérum physiologique phosphaté Analyse par cytométrie de flux  Cellules non transfecter= contrôle 10 Western blot  Les cellules KB-8-5 : -Plaquées dans 24 puits  24h plus tard: -Transfection avec ARNsi en utilisant oligofectamine

adéno-associés ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : Acide ribonucléique AMP : ampicilline B-UGT1 : bilirubine glucuronosyltransférase DMEM: Dulbecco modified Eagle medium EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique FACS : cymomètre de flux en fluorescence GFP: Green Fluorescent Protein Gag: group specific antigens Pol : polymérase Env. : enveloppe HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique IDLV : vecteur lentiviral déficient de l’intégration