Fluorochrome

greffés sur des billes magnétisées, ils sont alors éduqués pour accrocher des cellules spécifiques. Les cellules capturées sont alors récupérées de la fraction grâce à un aimant. La 2eme techniques est la FACS, les anticorps sont marqué par un fluorochromes puis les cellules sont séparées grâce a un appareil en font de leur marquage ou non par le produit fluorescent. Une souris est immunisée avec un antigène que l’on cherche à reconnaitre par ailleurs dans des expériences, les cellules de la rate

receuillies dans un milieu qui permettra de faire la réaction cytochimique. PCEM1 - Biologie Cellulaire 8/10 www.ProteinesPlus.fr Cours 01 - Les méthodes d'observation en Biologie Cellulaire On doit utiliser des marqueurs visibles: Fluorochrome, Enzyme (peroxydase), DAB (coloré ET dense aux electrons), Or colloïdale dense aux électrons à diamètre variable allant de 1-20 nm qu'on peut encore amplifier la réaction avec des sels d'argent. La réaction pourra se faire de 2 manières: • Méthode

cytologiques (cellules) qui peuvent être vitales ou non (viabilité de la cellule) – Marquage radio-isotopique 3H, 14C ou 32P) de précurseurs utilisés (ex : 3H-thymidine incorporé dans l'ADN) par la cellule et visualisation après autoradiographie – Fluorochromes (anticorps, sondes, GFP) – Une fixation préalable des cellules est souvent réalisée (toujours pour les tissus) avant l'observation voire le marquage. – La fixation permet d'immobiliser et de conserver les cellules, de stabiliser et figer ses

|Chaîne respiratoire | |Flavines |450 |530 |Chaîne respiratoire | Spectre d’absorption des fluorochromes endogènes Spectre d’émission des fluorochromes endogènes Les cellules cancéreuses ont un hyper métabolisme et produisent par exemple davantage de NADH, elles émettront donc davantage de fluorescence dans le pic de fluorescence du NADH, et cette fluorescence

de la lumière à angle droit) et l'intensité de fluorescence avec trois fluorochromes différents. On peut ainsi collecter une population cellulaire définie selon les paramètres choisis et mesurés. Cette technique permet ainsi le tri de populations cellulaires en fonction de leur expression de certains antigènes de surface qui seront marqués par des anticorps de différentes spécificités couplés à différents -121- fluorochromes. C'est le cas par exemple de l'analyse des populations de thymocytes. Ainsi

On predit que dans quelques années il faudra un quart d'heure et 150€ . On peut aussi supposer que notre séquence d'adn sera inscrite sur notre carte vitale.... CGH: on veut comparer le genome d'une c tumorale et d'une c normale. On met un fluorochrome vert sur les cellules normales et un rouge sur les cellules tumorales. On reccupere des 60 meres qui representent l'ensemble du genome humain. Il va y avoir une majorité de points jaune (rouge +vert), ce sont les sequences communes aux deux genomes

blastomères. Colorants : dextrane Polysaccharide, poly glucose couplé a fluorochrome molécule fluorescente grande molécule donc ne sort pas de la cellule donc par d’effet de diffusion. Molécule inerte qui ne perturbe donc pas le métabolisme et non dégradable. Elles sont très hydrosolubles. La molécule fluorescente est très variable : rhodamine ou fluorescéine etc. On peut faire des marquages multiples en changeant juste le fluorochrome. On peut également combiner les méthodes. Si on a peur que sa diffuse :

cellules eucaryotes à l’hématocycline. Marquage des échantillons pour la microscopie à fluorescence Dans la plupart des cas, l'utilisation de réactifs eux-mêmes fluorescents, les fluorochromes, rend possible l'identification des composants intra-cellulaires avec une grande précision et une grande spécificité. Les fluorochromes sont des marqueurs fonctionnant comme des colorants en se liant à certains éléments constitutifs de la cellule. Il n’existe pas de réactifs spécifiques pour tous les éléments

de discriminer différents types cellulaires en 6 fonction de leurs paramètres de taille et de structure. Elles émettent un signal de fluorescence appelé « autofluorescence » auquel se rajoute le signal émis par les anticorps couplés à des fluorochromes et qui ont marqué les cellules après un temps d’incubation (immunophénotypage) (Fig. 3). Le logiciel d’analyse intègre les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesurés et les représentent sous deux formes ; des histogrammes

les cellules. Convient pour les organismes en culture, non agrégés. Risque fréquent de colmatage de l’orifice. Cytomètre de flux (présentation optionnelle) Les cellules doivent être marquées avec des anticorps fluorescents spécifiques ou des fluorochromes (marquant l’ADN). La suspension cellulaire est aspirée et les cellules défilent les unes à la suite des autres devant un faisceau laser. Un 1e détecteur renseigne sur la taille de la cellule (intensité de lumière dispersée proportionnelle à la