Fluorochrome

estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique. Méthode basée sur la fluorescence Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de DNA émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente. Les différents fluorochromes: -Se fixant spécifiquement sur des paires de bases: Bases A-T: Hoechst 332 et DAPI Bases G-C: mithramycine - Intercalants: Iodure

méthylène phéniqué pendant 30 secondes. * Laver à l’eau, essuyer la face inférieure et laisser sécher. Au microscope les BAAR apparaissent en rouge sur un fond bleu. Coloration à l’auramine * Indications : Appelée aussi coloration par les fluorochromes, c’est l’une des variantes la plus couramment utilisée de la coloration de Ziehl-Neelsen. L’auramine permet de colorer et mettre en évidence le bacille de Koch, ou bacille de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) ainsi que celui de la lèpre

est une technique permettant d’identifier des chromosomes. Des sondes (qui sont des fragments d’ADN) s’associent spécifiquement à une partie du chromosome, ce qui le colore. Principe de la HFIS A : sonde B : sonde colorée à l'aide d'un fluorochrome C: hybridation avec l'ADN nucléaire D: apparence du chromosome métaphasique où la sonde s'est fixée Identification des chromosomes humains par HFIS - "Chromosome Painting" Plusieurs sondes sont utilisées, chacune s’associant spécifiquement

et pesée de l’échantillon, l’ADN est extrait. Ensuite, une partie du gène cytb (310pb) est amplifié par PCR à partir de l’ADN purifié. Le gène cytb est le marqueur de référence pour la phylogénie des vertébrés. L’ADN est ensuite marqué par un fluorochrome. L’amplicon est clivé par des agents chimiques et de la chaleur. L’hybridation sur la puce est réalisée à partir de l’échantillon obtenu.   Hybridation sur la puce d’analyse 97 000 sondes différentes sont produites sur une surface de verre de

microscopique des cellules, il est toujours nécessaire d'effectuer un grossissement à l'aide d'un microscope optique pour pouvoir les observer et les dénombrer. Il est possible de différencier les cellules vivantes des cellules mortes par utilisation d'un fluorochrome et analyse par un microscope à épifluorescence. Toutes ces méthodes requièrent de travailler sur un échantillon représentatif de la suspension, obtenu par prélèvement après homogénéisation, éventuellement sur plusieurs échantillons si une grande

fragment tissulaire et on effectue une dissociation cellulaire en utilisant des enzymes protéolitiques + agents chélateurs (EDTA) + polyssaccharide / polypère plastique (quand les anticorps vont se coller à la cellule ==> allourdit la cellule) + fluorochrome. ==> on les obtient grâce à : cytofluorimètre : matrice dotée d'une charge positive à une molécule portant un marquage fluorescent. Chélateurs : molécule capture certains ions (Ca2+) et diminue l'adhérence entre cellules. Pour trier

est ensuite lavée par des bains spéciaux pour éliminer les brins d'ADN ne s'étant pas hybridés car non complémentaires de ceux fixés sur la lame. On peut ensuite faire un scanner de la puce pour voir s’il y a eu hybridation ou pas et grâce aux fluorochromes on pourra traduire les couleurs apparaissantes. d) Les enjeux économiques et scientifiques. Aujourd’hui les puces à ADN sont devenues un enjeu économique capital même si parfois le profit économique laisse côté la science. Certaines sociétés

thymidine qui n’existe pas à l’état naturel. BrDU se comporte exactement comme la thymidine. Son incorporation dans l’ADN des cellules en phase S peut être détectée à l’aide d’un anticorps spécifique dirigé contre BrDU et qui peut être couplé à un fluorochrome (donc fluorescent) ou à la peroxydase. Le principe est le suivant : sur une culture de cellule, il est rajouté de la BrDU pendant un temps déterminé. Les cellules sont lavées pour éliminer la BrDU non incorporée puis marquées à l’aide de l’anticorps

indirecte Cette technique comprend deux temps successifs où l’anticorps spécifique de l’antigène recherché joue le rôle d’anticorps dans le premier temps, et le rôle d’antigène dans le deuxième temps. Ce n’est pas cet anticorps qui porte le fluorochrome mais l’antianticorps que l’on dépose dans le second temps. Les anticorps fluorescents peuvent être utilisés pour identifier directement les bactéries dans les échantillons cliniques mais aussi pour permettre une détection rapide des bactéries

analyses lié au débit important des laboratoires équipés. 3.2 immunofluorescence indirecte (IFI) -support : cellule infectées fixées sur une lame porte-objet. -réactif : anti-globulines humaines (totales ou spécifiques de classe) conjugué à un fluorochrome. -lecture : microscope à fluorescence -technique rapide mais spécificité imparfaite : interprétation subjective nécessitant observateur entraîné. -pas d’automatisation : petites séries. 3.3 Techniques d’immuno empreintes : « immuno blot »