Denombrements des micro-organismes

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  • Publié le : 28 avril 2011
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DENOMBREMENTS DES MICRO-ORGANISMES

Méthodes de dénombrements directes :

Cellule de THOMA :
Lame de verre épaisse creusée de 2 gouttières avec, entre les 2, un quadrillage de dimensions connues. L’épaisseur de liquide entre la lame et la lamelle est contrôlée et connue (0,1 mm). Le volume de comptage est donc calculée : V= (côté carré)2 x hauteur (en mm3, x 10-3 si expression en mL).Numération des cellules totales (vivantes et mortes) par carré : N cellules
Concentration cellulaire = (N/V) x facteur dilution
Convient bien pour les organismes en culture, pas trop petits, peu agrégés, non mobiles. Méthode précise mais un peu fastidieuse (nécessité de compter un nombre suffisant de cellules pour avoir une précision suffisante). Dénombrement total car difficile de distinguer entrecellules vivantes et cellules mortes. Néanmoins, une coloration cytologique préalable (discriminant les cellules vivantes des cellules mortes) permet de contourner ce problème.

Compteur de particules (COULTER counter) (présentation optionnelle)
Dénombrement automatique des cellules en suspension dans une solution d’électrolyse : 2 électrodes de platine, sous tension continue, situées de part etd’autre d’un tube percé d’un micro-orifice, plongent dans un électrolyte. Une aspiration en haut du tube entraîne le passage des cellules à travers l’orifice (= déficit d’un volume d’électrolyte correspondant au volume de la cellule ------> augmentation de la résistance du circuit)
Numération des cellules totales (vivantes et mortes).
La suspension ne doit pas contenir de particules inertes demême taille que les cellules. Convient pour les organismes en culture, non agrégés. Risque fréquent de colmatage de l’orifice.

Cytomètre de flux (présentation optionnelle)
Les cellules doivent être marquées avec des anticorps fluorescents spécifiques ou des fluorochromes (marquant l’ADN). La suspension cellulaire est aspirée et les cellules défilent les unes à la suite des autres devant unfaisceau laser. Un 1e détecteur renseigne sur la taille de la cellule (intensité de lumière dispersée proportionnelle à la taille), un 2e détecteur renseigne sur la fluorescence associée à la cellule.
Permet de différencier des populations de cellules différentes, mais même limites que pour le Coulter counter.

Microscopie à fluorescence pour compter les cellules déposées sur un filtre (présentationoptionnelle)
Un volume connu de suspension cellulaire est filtrée sur un filtre retenant les cellules. Les cellules doivent être rendues fluorescentes (DAPI ou Acridine orange par ex. pour prendre en compte toutes les cellules, ou anticorps fluorescents spécifiques pour différencier des populations).
Limites semblables à celles de la cellule de THOMA et technique plus longue. Utilisable pourdes cellules extraites de l’environnement, mais la suspension doit être peu chargée en particules inertes (colmatage du filtre, gêne pour l’observation).

Méthodes de dénombrements indirectes :

On ne compte pas directement les cellules. Nécessitent une phase de culture donc on ne prend en compte que la flore cultivable dans les conditions utilisées (type de milieux, température, conditionsd’oxygénation…).
Méthodes relativement peu précises mais utilisables aussi bien pour des cellules en culture que pour des cellules extraites d’environnements variés. Les cellules doivent être dispersées de manière aléatoire dans la suspension donc ne convient pas pour des organismes filamenteux, agrégés. Suivant la nature du milieu, on peut s’intéresser à une communauté microbienne assez large (milieutype bouillon nutritif gélosé ou non, par ex.) ou au contraire plus restreinte (milieu sélectif avec antibiotique par ex.).

Ces techniques comprennent plusieurs étapes :
- Réalisation d’une série de suspensions-dilutions à partir de la suspension initiale (culture pure ou micro-organismes extraits ) lorsque la densité cellulaire est élevée (ou au contraire concentration des cellules par...
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