A Ferrare, elle réunit autour d'elle une foule d'hommes doctes, dont de nombreux protestants, venus d'Italie, d'Allemagne, de France, de Genève; elle employa comme secrétaires Lyon Jamet et Clément Marot, protégea de nombreux coreligionnaires poursuivis pour leurs idées religieuses : Camillo Renato, Lodovico Domenichi, Isabelle Bressegna, etc. Elle rassembla autour d'elle, dans les années cinquante, des réfugiés venus de l'Europe entière, sans manifester pour autant le désir de structurer ce mouvement à la manière des calvinistes de Genève.
L'année-charnière de son séjour italien, celle où se déploie son engagement politique et religieux est 1536 : elle reçut au printemps Jean Calvin qui s'arrêta à Ferrare ; elle défendit avec succès un chantre arrêté pour ses propos blasphématoires au sortir de la messe, le jeudi de la Cène ; enfin elle fit libérer son secrétaire, Jean Cornillau, emprisonné pour n'avoir pas répondu à la convocation ducale. François Ier, par le biais de ses ambassadeurs à Venise Georges de Selve, évêque de Lavaur et Georges d'Armagnac, futur cardinal, intervint en sa faveur et Marguerite de Navarre relaya le bruit, que propageait Michelle de Saubonne,dame de Parthenay, sa dame de compagnie, selon lequel Hercule II cherchait à faire mourir de désespoir et de honte sa femme. Dès 1537, semble-t-il, elle commença à correspondre avec le réformateur de Genève, Jean Calvin, qui signait "Charles d'Espeville" : les derniers éditeurs des œuvres de Calvin (Droz, mars 2006) ont revu la datation de la première lettre du réformateur que l'on plaçait jusque là en 1541. Ses livres de comptes, conservés à Turin, témoignent de son engagement calviniste, et de l'achat de nombreux ouvrages réformés.
L'année 1554 représente une cassure dans cet engagement : admonestée par Matthieu Ory, grand inquisiteur de France envoyé par Henri II, emprisonnée et interrogée par le jésuite Jean Pelletier en présence de l'inquisiteur local de Ferrare, Girolamo Papino, isolée au