PREAMBULE :

La prothrombine (ou le Facteur II) est une chaîne polypeptidique précurseur de la thrombine (ou le Facteur IIa), protéinase qui initie la dernière étape de la cascade de coagulation du sang par dégradation du fibrinogène en fibrine (voir figure 2). Le TP propose de réaliser 2 des 3 principales étapes de purification de la prothrombine issue du plasma de sang de cheval. Un test enzymatique coloré (chromogénique) vous permettra de suivre spécifiquement cette activité. Sang citraté (non coagulé)
Centrifugation pour enlever les cellules (globules rouges, plaquettes, globules blancs etc...)

Plasma citraté « pl »
Surnageant « S1 » Précipitation au BaCl2

Précipité « C1 »
Surnageant « S2 » Précipitation au BaCl2

Précipité « C2 »
Dialyse Fractionnement par précipitations au sulfate d'ammonium (entre 40 et 60%) et dialyse

Précipité à 40% Surnageant à 60%

Eluat < 0,1M NaCl

Chromatographie échangeuse d'ions

Eluat à 0,1M NaCl = Prothombine Echantillon « Pro »
Test de stabilité de la Thrombine par dénaturation à l'urée

Deux des étapes de purification de la prothrombine équine « précipitation au BaCl2 » et « chromatographie échangeuse d'ions ». NB: Toutes les échantillons seront conservé dans de la glace. I-Précipitation au BaCl2 :

:

Il s'agit de la première étape de purification de la prothrombine à partir du plasma équin. 1 mL de plasma equin BaCl2 1M (toxique !) Solution saline « SS » : 9% NaCl et 0,2 M de trisodium citrate EDTA 0,2M pH 7,4 froid a-Activité de départ :
–

Prélevez un aliquote de plasma (tube « pl ») 50 µ L, pour mesurer l'activité de la thrombine ultérieurement (conservé dans la glace) : cf. partie Id pour la préparation de l'échantillon puis l''annexe 1 pour le test d'activité.

b-Première précipitation :
–

– –

– – –

Ajouter 80 µ l de BaCl2 1M en goutte à goutte sur le plasma restant (env 1 mL) : ajouter une goutte, puis refermer le tube et homogénéisez par retournement, rajouter une goutte,