L'influence des canaux ikca1 sur les cancers de la prostate

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  • Publié le : 10 avril 2011
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Intro :
Aspect général : Pourquoi cette étude ?

- Rechute des cancers prostatiques (cause de mort importante dans les pays de l’ouest) sous une forme réfractaire aux hormones, suite aux thérapies standards (« androgen ablation » = inhibition de la production d’androgènes : ablation testiculaire, prise d’hormones féminines, prise d’anti-androgènes)
- Nouvelle approche : Rôle d’IKCa1Détails : Pourquoi IKCa1 ?

- Canaux K+ : Rôle dans la prolifération cellulaire + cancérogénèse (( ?) cf. hEAG-1 = oncogène)
- Canaux KCa : Intérêt dans les mécanismes liés au cancer
- Canaux IKCa1 : Augmentation de l’expression dans les LT activés et les cancers du pancréas
Modulation au cours du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses
Pharmacologie : IKCa1dans les cellules PCa
Sortie de 86Rb+ (analogue K+) et prolifération induite dans cellules LNCaP et PC-3 par 1-EBIO (activant IKCa1) inhibés par des IKCa1-bloquants

But :

- Expression d’IKCa1 dans les PCa
- Mécanisme de régulation de la [Ca2+]i et de la prolifération cellulaire

Matériel et Méthodes :

Etude de cellules oncologiques prostatiques :
- Lignées sensibles aux androgènes(LNCaP) et insensibles (PC-3 et DU-145)
- Cultures primaires d’épithélium humain : hPCE
* des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "culture primaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions (limite de Hayflick).
* des cellules ayant unecapacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

A partir de patients :
Comparaison de PCa humaines et de biopsies de BHP (hyperplasie prostatique bénigne)

Analyse de l’expressiond’IKCa1 :
- RT-PCR : isolation d’ARN total, expériences RT-PCR, primers PCR (Genbank + Invitrogen)
- Immunofluorescence

Association d’IKCa1 et TRPV6 :
- Transfection cellulaire de siRNA
- Western Blot et immunoprécipitation

Rôle dans la prolifération :
- Prolifération et apoptose
Mécanismes induits à cet effet :
- la régulation de l’entrée de calcium :
Mesures de [Ca2+]i (imagerie calcique)- l’hyperpolarisation :
Electrophysiologie - Patch Clamp

Analyses statistiques

Résultats :

Figure 1 :

L’expression d’IKCa1 dans les lignées cellulaires et tissus cancéreux humains :
a) RT-PCR : Marqueur de taille entre 506 et 1018 pb. H2O comme marqueur négatif. Amplification du fragment de taille attendue du cDNA dans toutes les lignées cellulaires (LNCaP, DU-145, PC-3 et hPCE) :hybridation avec les primers spécifiques (électrophorèse, fragments amplifiés). Clonage et séquençage de PCR amplifiée : confirmation de la spécificité et correspondance avec la séquence publiée pour l’ARNm humain du canal IKCa1.
b) WB : B-Actin : contrôle de la quantité d’équivalents ARN dans la RT-PCR. Validation de la spécificité de l’anticorps – IKCa1 (dirigé contre 16AA de l’extrémitéN-terminale de la protéine) : il révèle une bande de 52+/-2kDa dans les protéines issues d’HEK-IKCa1 (Human Embryonic Kidney de HEK-293 portant le cDNA codant pour IKCa1) (et pas dans celles de HEK-Neo : transfectées avec un vecteur vide). La taille attendue de la séquence d’AA était de 47kDa : modifications post-traductionnelles.
c) WB : expression de protéines IKCa1 dans les cellules cancéreuseshumaines de la prostate : avec l’anticorps correspondant on révèle une bande similaire (52kDa) à celle de b) dans LNCaP et PC-3 (confirmation en immunofluorescence)
d) Electrophorèse en gel d’agarose, niveau d’ARNm* par analyse RT-PCR, niveau protéique par immunofluorescence : expression de gène IKCa1 dans biopsies de 6CP et 9BPH : bande de 867pb révélée dans respectivement 5/6 et 1/9 :...
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