CO TP

4490 mots 18 pages
TP 2 Protéine-Enzymologie-Métabolisme

Purification partielle et dosage de l'activité enzymatique de la β-galactosidase

La β-galactosidase comme nous l'avons vu au précédent TP, est une enzyme présente chez les micro-organismes, les animaux et les plantes et qui a pour principal substrat le lactose, qu'elle catalyse en galactosidase et glucose.

Pour réaliser notre TP2, nous avons utilisé un extrait bactérien contenant notre enzyme d’intérêt, issu de Escherichia coli, et qui a subi comme dans le TP1 une sonification dans un tampon Tris-HCL mM de ph 8, afin de séparer par centrifugation le lysat des débris cellulaires. On incube également le sonicat bactérien avec une endonucléase de l'ADN : la DNAse I de microccocus, et on réalise une dialyse dans un tampon Tris-HCL 20mM, ph 8. Ces étapes sont nécessaires pour mener à bien notre purification, car la β-galactosidase se trouve dans un milieu à ph 8 et porte donc une charge globale négative car son phi est de 4,6. Cette incubation et cette dialyse nous permettent donc d'éliminer partiellement les acides nucléiques chargés négativement et les molécules de masse moléculaire inférieure à 12 000 Da (un nucléotide a une masse moléculaire de 330 Da). En effet, la chromatographie sur résine échangeuse d'ions est une technique de purification sur le critère de la charge, qui nous permet d'isoler partiellement la β-galactosidase des autres molécules de l'extrait bactérien. Or si on laisse l'ADN et les nucléotides qui sont chargés négativement dans l'extrait bactérien, on récupère au final la β-galactosidase mais également l'ADN et les nucléotides.

Le but de ce deuxième TP et de réaliser une purification partielle de la β-galactosidase provenant d'un extrait bactérien, par chromatographie sur résine échangeuse d'ions et d'analyser le résultat de cette purification. Pour cela, on l'analyse de manière

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