La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme tétramérique catalysant la conversion réciproque du pyruvate et du lactate accompagnée de la conversion simultanée du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de deux types de sous-unités différents M et H, et pouvant s'associer en cinq isoenzymes différentes. Le but de ce TP est de purifier la LDH, ici de façon partielle, au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne.
Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur la complémentarité d'une protéine pour un ligand fixé sur un support macromoléculaire insoluble. On cherche à isoler une protéine présente dans un mélange. La protéine que l'on cherche à purifier se fixe spécifiquement au ligand, et est donc retenue contrairement aux autres protéines et impuretés présentes dans le mélange qui sont éliminées. On peut ensuite, après un rinçage, éluer la protéine d'intérêt en utilisant un tampon d'élution de pH différent, ou comportant une forte concentration d'une molécule possédant également de l'affinité pour le ligand, la protéine est libérée par compétition pour le site de fixation.
A partir d'un extrait d'homogénat de foie de rat, on choisit d'isoler la LDH sur du bleu de Cibacron, qui est un analogue du NADH/NAD+, fixé par covalence à un gel d'agarose. L'enzyme se fixe alors au bleu de Cibacron, laissant ainsi les impuretés passer entre les mailles du gel d'agarose que l'on récupère. Après rinçage, on peut ensuite éluer la protéine qui se trouve encore dans la colonne. La purification ne sera que partielle car le bleu de Cibacron est relativement peu spécifique de la LDH, en effet il est spécifique à un groupe de protéine. On récupère enfin l'enzyme après lavage par un tampon contenant du NADH, le ligand compétiteur, et de l'oxamate. L'oxamate se liera avec l'enzyme permettant ainsi de la libérer du gel au moyen d'une élution par compétition, car le NADH se fixera sur le ligand, on obtient alors l'extrait enzymatique ou essaie. On