Niveau TS spécialité Les enjeux actuels des biotechnologies. Transgénèse et construction d’organismes génétiquement modifiés.
PREPARATION DES BACTERIES COMPETENTES Protocole n° 1’
Chaque binôme dispose d’un erlenmeyer qui renferme 50 mL d’une suspension de bactéries cultivées sur un milieu favorable à leur croissance.
A cette étape, il faudra manipuler dans des conditions stériles et le plus souvent à 0 °C. Prendre une boite en polystyrène et la remplir de glace pilée récupérée dans la réserve de glace.
1. Prélever stérilement 1 ml de suspension de bactéries et effectuer au spectrophotomètre une mesure de la densité optique (DO). Cette dernière permet d’évaluer la croissance bactérienne. Vérifier que la DO550 a atteint une valeur située entre 0,3 et 0,4.
2. Arrêter la croissance en mettant l’erlenmeyer dans la glace. À partir de cet instant, les cellules doivent rester à la température de 0°C : placer tous les tubes et les tampons nécessaires dans la glace avant de mettre les bactéries en contact avec eux.
3. Transvaser la suspension bactérienne dans un tube à centrifuger de 50 mL, stérile et froid.
4. Laisser reposer au moins 10 minutes dans la glace.
5. Se déplacer en conservant les bactéries dans la glace jusqu’à la centrifugeuse qui est en chambre froide et centrifuger 5 min à 4000 rpm et 0°C.
6. Vider le surnageant dans l’évier en renversant votre tube franchement.
7. Ajouter 4 mL de CaCl2 50 mM froid (mesurés approximativement sur les graduations du tube) et remettre délicatement les bactéries en suspension (alterner agitation et remise des bactéries dans la glace pour éviter de les réchauffer).
8. Une fois le culot bactérien entièrement remis en suspension, compléter jusqu’à environ 13 mL de CaCl2 50mM froid (graduations du tube). Remarque : l’ajout de CaCl 2 permet de rendre les bactéries compétentes en ouvrant des pores dans leur paroi.
9. Laisser reposer 10 min dans la