Les Européens arrivèrent dans la région au XVIe siècle. Asunción fut fondée par Juan de Salazar en 1537, le jour de l'Assomption, d'où son nom initial Nuestra Señora de la Asunción (Notre-Dame de l'Assomption). Asunción devint une ville importante de l'Amérique du Sud. De nombreuses missions jésuites et de nombreux colons passèrent par cette ville. Les années 1610 à 1767 furent celles de la domination jésuite sur les Indiens Guaranis de la province jésuite du Paraguay, qui comprenait une partie du Paraguay actuel, mais aussi une partie du Brésil et de l'Argentine (actuel État argentin des Misiones). La présence jésuite se manifesta notamment par la création, à partir de 1609, de « réductions », villages composés de plusieurs centaines ou milliers d'Indiens sédentarisés et encadrés seulement par deux jésuites. On a pu à cet égard parler de « communisme chrétien » (Clovis Lugon), dans la mesure où la vie des Guaranis était communautaire (jusqu'à la distribution chaque matin des outils pour aller travailler aux champs) et fortement encadrée par la religion (messe obligatoire à 5h 30, le matin, et journée rythmée par les célébrations religieuses). En 1611, par les ordonnances d'Alfaro, la monarchie espagnole fournit à cette institution une base législative claire. Les réductions sont strictement interdites aux blancs, noirs et métis. Les Indiens sont exemptés du système de l'encomienda, selon lequel des Indiens, confiés à un colon, devaient recevoir de lui protection et instruction chrétienne en échange de travail sur son exploitation. La province du Paraguay a appartenu à la vice-royauté du Haut-Pérou jusqu'à la création du vice-royaume du Rio de la Plata en 1778, dont le Paraguay devint une des Intendances en 1783, et se situait dans une région stratégique, lieu de passage entre les mines péruviennes (notamment les mines d'argent du Potosi, en Bolivie) et le port de Buenos Aires, par lequel les métaux gagnaient l'Espagne. Par conséquent, l'économie des