Tp clonage

3435 mots 14 pages
HARDY David ROCCHETTI Loïs BCMP 1

Amplification de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, par PCR et son sousclonage dans le vecteur d’expression pGEM-T

Amplification de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, par PCR et son sous-clonage dans le vecteur d’expression pGEM-T.
I) Introduction :

L’objectif de ce Tp est de sous cloner l’ADNcomplémentaire à l’ARNm codant pour la Tyrosine Amino Transférase de Rat. Pour cela, l’ADNc sera inséré dans un plasmide et pourra donc être transcrit in vitro en ARN qui sera utilisé comme sonde pour étudier l’expression du gène TAT.

A

A

Souche ayant intégré le plasmide non recombinant, elle est résistante à l’ampicilline et possède, la partie NH2terminale au niveau du plasmide et C terminale au niveau de l’ADN bactérien, de la protéine βGalactosidase. Cette souche pourra dégrader le X-Gal en Gal+X(de couleur bleue)

Souche ayant intégré le plasmide recombinant, elle est résistante à l’ampicilline. Elle ne possède pas la partie codant pour la partie NH2 terminale de la βGalactosidase. Cette souche ne pourra pas dégrader le XGal en Gal+X(de couleur bleue)

Souche ayant intégré le plasmide recombinant mais l’insert est inversé, elle est résistante à l’ampicilline. Elle ne possède pas la partie codant pour la partie NH2 terminale de la βgalactosidase. Cette souche ne pourra pas dégrader le X-Gal en Gal+X(de couleur bleue).De plus, cette souche ne pourra pas être utilisée pour synthétiser la sonde ARN car elle ne contiendra pas l’ORF.

Figure1 : Protocole expérimental

2

II)

Amplification de L’ADNc TAT par PCR :

Le principe de la Polymerase Chain Reaction est d’obtenir en grande quantité un fragment d’ADN précis. Pour cela il faut un fragment d’ADN de base (celui que l’on veut dupliquer), des nucléotides (dNTPs), des amorces choisies pour amplifier que la partie qui nous intéresse, une ADN polymérase (ici la Taq polymérase isolé de la bactérie thermophilus aquaticus résistante à de

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