Tp de génie génitique rendre les bactéries compétentes par cacl2 et le choc thermique

Pages: 12 (2760 mots) Publié le: 6 octobre 2012
LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE D'ADN
Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire permettant d'isoler des gènes spécifiques, de les reconstruire puis de les réinsérer dans des cellules ou des organismes. Ces techniques ont fourni à la médecine et à l'industrie un moyen efficace de produire en grandes quantités des protéines spécifiques, qui, auparavant, n'étaientdisponibles (si elles l'étaient) qu'en quantité extrêmement faibles. Ces techniques ont permis également d'étudier la régulation de leur expression et ainsi de mieux comprendre le développement de maladies génétiques.
Les différentes étapes passent par : la construction d'une banque d'ADN, le criblage de la banque et l'expression du gène.
1. Construction d'une banque d'ADN : clonage de gène.
Onpeut distinguer 2 méthodes permettent de construire une banque d'ADN. La première consiste à fragmenter la molécule d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction, la seconde consiste à purifier de l'ARN messager qui seront ensuite transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par une transcriptase inverse.
1. 1. Préparation d'une banque d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction : banque d'ADN génomique.Préparation de l'ADN.
Les enzymes de restriction (voir polycopié introduction au génie génétique) sont des nucléasse purifiées à partir de bactéries qui coupent l'ADN au niveau de séquences spécifiques de 4 à 8 nucléotides, produisant des fragments d'ADN de tailles strictement définies, les fragments de restriction.
Les enzymes de restriction sont utilisées pour produire de petits fragments d'ADNrenfermant un gène particulier.
Une autre propriété des enzymes de restriction, commode pour le clonage des gènes, est la capacité, pour beaucoup d'entre elles, de provoquer des coupures en « zig-zag » qui laissent de courtes extrémités monocaténaires aux 2 extrémités du fragment d'ADN : les extrémités cohésives. Ces extrémités peuvent former des paires de bases complémentaires avec n'importe quelleautre extrémité produite par la même enzyme. Ainsi, cela permet de relier 2 fragments d'ADN double hélice provenant de génome différents par appariement de bases complémentaires.

Les extrémités cohésives produites par de nombreux types de nucléases de restriction permettent de relier deux fragments d'ADN par des appariements de hases complémentaires. Les fragments d'ADN ainsi réunis peuvent êtreliés de façon covalente au cours d'une réaction très efficace catalysée par t'ADN ligase. Dans cet exemple, une molécule d'ADN recombinant de plasmide contenant une insertion d'ADN chromosomique est formée.
Par exemple, un fragment d'ADN contenant un gène humain peut être relié au chromosome d'un virus bactérien en tube à essai. La nouvelle molécule d'ADN recombinante peut ensuite être introduitedans une cellule bactérienne. Sachant que le mécanisme de réplication normal d'un virus peut engendrer plus de 1012 molécules d'ADN viral identiques en moins d'un jour, l'ADN humain est ainsi considérablement amplifié. Le virus est appelé vecteur de clonage.
Les vecteurs de clonage.
Un vecteur de clonage est une petite molécule d'ADN qui possède les propriétés suivantes : pouvoir se répliquerdans une bactérie fortement amplifiable posséder des sites de restriction permettant d'introduire le fragment d'ADN à cloner posséder 2 types de marqueurs : marqueurs de transformation qui permet de faire la distinction entre des bactéries transformées (ayant reçu le vecteur) et les autres marqueurs de recombinaison qui permet de faire la différence entre des bactéries ayant reçu le vecteur seul decelles ayant reçu le vecteur recombinant (c'est à dire avec l'ADN d'intérêt).
Il existe 3 types de vecteur de clonage : plasmidiques, viraux et cosmides (phage associés à des plasmides). Les-vecteurs plasmidiques de première génération sont dérivés du plasmide pBR322.
Actuellement, on utilise préférentiellement des vecteurs plasmidiques de seconde génération : le plasmide pUCIS et ses...
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